骨髓基质干细胞成骨的研究进展

作者:吴志明,王东,栗树伟 

作者单位：山西医科大学第二医院，山西 太原 030001  　　组织工程技术是目前解决大块骨与软骨组织缺损修复难题最有前景的手段之一，种子细胞是组织工程学中的重要环节。骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)是一类具有多向分化潜能的组织干细胞，在体内外适当的诱导环境下可以分化为骨、软骨、脂肪、肌肉、神经、肌腱及韧带等多种组织细胞。该细胞群来源充足，取材方便，增殖能力强，可在体外大规模扩增而不丢失多向分化潜能，并且异体移植免疫排斥反应小，目前已成为应用较广泛的重要种子细胞之一。本文就骨髓基质干细胞成骨问题进行阐述。

　　1  骨髓基质干细胞的来源与获取    　　骨髓基质干细胞可来源于机体各个部位骨髓。人通常取自髂骨，兔取自股骨髁上。对人而言，不同部位来源的BMSCs功能状态不一。椎骨来源的BMSCs碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性低于股骨来源的BMSCs，而骨钙素mRNA的水平较后者高。BMSCs的数量随着年龄的增长也不断减少，鼠在21个月时股骨干骨髓中的细胞要少于4个月时的骨髓细胞。BMSCs在骨髓中含量极少(1×105个单核细胞中含有1个BMSCs)，因此要求在体外培养扩增后，才能达到组织工程学所要求的细胞数目。在抽取骨髓血的过程中，每一个部位抽出量不应超过2 mL，否则将因抽出物中血量增加而引起有核细胞数的明显下降。    　　常用获得BMSCs的方法有：a)贴壁法。所得细胞成分复杂，BMSCs的纯度不足；b)密度梯度离心法。该方法基于沉降作用，这是较简便且实用的分离方法，它能有效地将红细胞、白细胞和间充质细胞分离开来。Lisignoli［1］研究发现，密度梯度离心法能增加BMSCs分化成为成骨细胞克隆的数量；c)流式细胞仪法；d)免疫学方法。免疫选择法通过骨髓基质干细胞表面带有或缺乏某些抗原标志，进行筛选，可获得相对纯化的基质干细胞。赵子义等［2］研究发现，利用免疫磁珠标记神经生长因子受体(nerve growth factor receptor，NGFR)抗体分离、纯化而获得NGFR＋MSCs比同样培养条件下贴壁法纯化BMSCs其扩增倍数高出2～3个数量级，并且其内含有更高比例具有多向分化潜能的细胞，所以分离骨髓NGFR＋细胞获得的BMSCs作为种子细胞应用于组织工程具有明显优势。但到目前为止，BMSCs的特异性表面抗原标志仍没有明确，并且缺少选择性分离BMSCs的方法。

　　2  骨髓基质干细胞的体外增殖生物学特性    　　对BMSCs细胞周期的研究表明，其大约有20％处于静止期，即G0期细胞，这说明BMSCs具有强大的增殖能力，但是有文献报道，高度传代(大于25代)的BMSCs中有一部分已经表现出凋亡的特征。BMSCs接种密度的大小直接影响BMSCs的增殖能力，低密度接种(5 000/cm2)BMSCs无论在扩增速度还是扩增倍数上都明显高于高密度接种，而极低密度接种(0.5～12/cm2)更有利于细胞的增殖。杨柳等人［3］在实验中也发现种植密度较高时，严重影响BMSCs的贴壁生长，考虑为含有的红细胞、白细胞比重大于BMSCs而首先沉积于瓶底，且细胞代谢废物增多所至。    　　BMSCs成骨活性随着供体年龄增长呈下降趋势，年龄越大，在培养中形成的群落和具有成骨样细胞特点的细胞越少，而且细胞对诱导因子的反应敏感性下降。    　　低氧张力条件下BMSCs培养，其细胞增殖速度大大提高，且细胞ALP表达也大大增强［4］。考虑其原因为机体内部的氧分压明显低于外界(140 mmHg)，特别是骨髓内氧分压只为30～50 mmHg，大约相当于外界的1/3，因此BMSCs长期暴露于高氧分压的状态，必将导致细胞过度氧化，功能下降。如果体外进行培养的条件与体内氧分压相似，则更有利于细胞功能的保留。    　　顾祖超等人［5］在实验中发现，兔BMSCs原代培养，其开始贴壁(1～2 d)的时间和完全贴壁时间(12～14 d)均长于传代培养的BMSCs。传代BMSCs不形成集落，形态更加单一，呈梭形，14 d之内没有形成明显钙化结节。BMSCs经诱导培养后的形态主要为多角形，其贴壁率有所下降，且在10～12 d之内形成明显钙化结节。传代细胞和诱导细胞两者的生长曲线无统计学差异，倍增时间为33.6～34.6 h，生长高峰均在接种后6～7 d出现。BMSCs长满单层后，可出现多层生长，没有发生接触抑制。   　　Sun等人［6］的研究还发现大鼠BMSCs抑制T淋巴细胞的扩增，认为此特性可使其应用于同种异体移植。Cancedda［7］指出，经过体外扩增，BMSCs在体内的成骨效率明显低于新鲜的骨髓，其在体外的多项分化潜能逐渐消失。

　　3  骨髓基质干细胞的诱导分化    　　由于BMSCs具有分化多方向性的特点，而骨组织工程学要求其向单一方向分化，所以BMSCs的定向诱导具有重要作用。就其成骨方向来说，具有诱导作用的有以下几种因素。

　　3.1  化学物质的作用

　　3.1.1  地塞米松(Dex)  Beresford等［8］发现在原代及传代细胞培养中均加入地塞米松时，骨髓基质细胞向成骨细胞及脂肪细胞转化，在传代培养中再加入1，25二羟维生素D3，则抑制其向脂肪细胞转化，通过骨钙蛋白mRNA分析证实向成骨细胞转化占优势。而仅在传代培养中加入地塞米松时，骨髓基质细胞多向脂肪细胞转化。    　　而Maniatopoulos［9］认为只有在地塞米松和β甘油磷酸钠存在的培养环境下，才能形成矿化骨样小结，形成矿化小结的时间、形状、数目与地塞米松加入的时间及剂量有关。

　　3.1.2  1，25羟基维生素D3(1，25(OH)2D3)  Kelly等［10］发现1，25(OH)2D3在促进BMSCs向成骨细胞分化的同时，能够抑制由糖皮质激素诱导的脂肪细胞分化。Faucheux等［11］研究表明，1，25(OH)2D3促进BMSCs中骨钙素水平升高，同时刺激BMP3 mRNA的表达，这种刺激在原代培养的BMSCs较已分化BMSCs更强。

　　3.2  细胞因子的作用    　　许多细胞因子如骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)、碱性成纤维细胞因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、转化生长因子β(transforming growth factorβ，TGFβ)等在BMSCs分化及增殖上起着重要的作用。

　　3.2.1  BMP  BMP是强有力的诱导因子之一，能够启动BMSCs的成骨过程，可能是诱导BMSCs向成骨细胞系转化的基本信号因子，诱导成骨最强的是BMP2、4、7。Rickard等［12］研究表明BMP2能够快速诱导BMSCs向成骨细胞转化，作用8～10 d观察到BMP2可明显促进BMSCs形态转变，并可提高BMSCs的ALP、骨涎蛋白、骨钙蛋白的mRNA的表达。同时指出，单独使用BMP的作用较联合使用地塞米松的骨诱导活性低，从而认为BMP可能并不能单独起作用，在整个骨诱导过程中可能需要激素的协同作用。而Kim等［13］认为BMP2可明显加速BMSCs向成骨细胞转化，但却不能促进骨钙蛋白的分泌，认为BMP可促进成骨细胞前体细胞向成骨细胞转化，但不能使之向成熟成骨细胞转化。

3.2.2  bFGF  bFGF能够促进BMSCs体外培养成纤维细胞集落的形成，促进细胞的增殖，但对BMSCs的转化作用仍存在不同的研究结果。Hanada等［14］认为在地塞米松存在的培养环境中，bFGF作用6 d时可显著增加细胞增殖，同时骨钙蛋白表达、骨矿化结节形成。BMP2的促转化作用不如bFGF明显，两者联合应用时促BMSCs转化作用强于单一因子。而Martin等［15］研究表明在众多生长因子中bFGF对BMSCs具有最强的促分裂作用，同时经bFGF作用的细胞植入体内表现出较强的成骨能力。

　　3.2.3  TGFβ  TGFβ是较强的促成骨分化的因子。Locklin等［16］研究发现TGF能够抑制BMSCs的增殖，但能提高其ALP的表达，并能减少和延迟BMSCs向脂肪细胞的转化，Andrades等［17］研究表明，基因重组人转化生长因子β可以诱导BMSCs向成骨细胞分化和成熟。

　　3.3  生物力学因素    　　生物力学因素在骨形成过程中的作用亦不容忽视，它可以影响细胞的生长、增殖和分化过程。Yoshikawa等［18］采用特制培养皿培养BMSCs，此培养皿可以对细胞产生周期性张力和拉力，同静态培养相比，外力作用下培养细胞的ALP活性、骨钙素水平、DNA含量、细胞干重均明显升高。

　　4  骨髓基质干细胞作为基因治疗的靶细胞用于骨缺损的修复    　　骨缺损的基因治疗是把具有促进成骨作用的基因导入靶细胞，既能诱导其向成骨细胞转化，使之发挥种子细胞的作用，又能在体内骨组织再生过程中持续高效地分泌生长因子，有利于组织工程化骨组织的形成。骨髓基质干细胞因其容易采集并进行组织培养，细胞表面有骨诱导蛋白的受体，具有明确的成骨潜能而成为常用的靶细胞。    　　Oyama等［19］将TGFβ1基因的复制缺陷型病毒转入成骨细胞中，转染后成骨细胞中TGFβ1 mRNA的表达仍保持在明显的上调状态，细胞分泌合成的TGFβ1较对照组高46倍，细胞Ⅰ型胶原含量提高了5倍，将转染了TGFβ1的成骨细胞植入体内可明显增加新生骨组织的数量。金丹等［20］研究表明经hBMP7基因转染的BMSCs增殖能力无明显改变，能够显著提高其合成胶原、ALP、骨钙蛋白、层粘连蛋白的能力，证实经hBMP7基因转染后能够促进BMSCs向成骨细胞转化。进一步利用经转染的BMSCs修复兔桡骨缺损，经大体观察、X线、组织学检测分析结果证实经转染的BMSCs修复骨缺损的成骨速度和成骨量均优于未转染BMSCs的对照组。如何控制外源基因在受体细胞内的表达时间和表达数量，使之与再生组织的需要相适应，仍需进一步研究。    　　总之，BMSCs是理想的骨组织工程学种子细胞，但是目前只停留在实验室阶段，要应用于临床，还有很长的研究道路要走。且现在多数研究只是针对于动物，对人的BMSCs特性及培养了解不多。人的BMSCs培养难度要高于动物，因此，建立一套骨髓基质干细胞提取、培养、分化的规范方法显得更加必要。

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