人Ras同源物基因家族成员B真核表达载体的构建及对肾癌细胞786-O增殖和凋亡的影响

RhoGTPase属于小G蛋白家族,是1组相对分子质量约20x103一25x10,的GTP结合蛋白,在细胞的信号转导通路中发挥重要作用,并影响肿瘤的发生和发展0人Ra、同源物基因家族成员B(R11oB)通常在正常上皮和早期肿瘤中较容易检测,但在恶性进展的侵袭期肿瘤中测不到,目前认为它在肿瘤中发挥负险调节作用.我们通过构建RhoB基因的真核表达载体并转染肾癌细胞株786-0,观察RhoB表达,并探讨其对786-0细胞增殖和凋亡的影响.　　材料与方法　　1.材料:peDNA3.0-Flag载体和人肾癌细胞株786-0均保存在本实验室.786-0细胞培养于含10%胎牛血清RPMI1640(Gibc.公司)中.限制性内切酶BamHI,EcoRI及T4DNA连接酶均购于美国NEB公司;小量质粒提取试剂盒购于北京天根生化科技有限公司、胶回收试剂盒及MTS试剂盒购于美国Promega公司.转染试剂Lipofection2000购于Invitroge.公司;细施凋亡试剂盒购于碧云天生物技术研究所;兔抗人RhoB抗体购于Proteintech公司,碱性磷酸酶标记山羊抗兔IgG购于中杉金桥公司.　　2.RhoB的全长基因的扩增:依据GcncBank人RhoB基因序列和pcDNA3.0-Flag的多克隆位点序列设计引物在上下游引物的5’端分别加入限制性核酸内切酶BamHI和EcoRI的酶切位点(下划线部分)序列如下:5'-CGCGGATCCATGGCGGCCATC-CGCAAGAA-3,5’-CCGGAATTCTCATAGC}CCTTG-CAGC.}GT-3',扩一增片段长度为591帅利用肾癌细胞株786-0逆转录获得cDNA,进而利用聚合酶链反应(PCP.)获得RhoB的全长基因,反应条件为:95℃预变性3min,950C变性30x,600C退火30x,720C延伸1min,共35个循环,720C再延伸5min终止反应.　　3.PCR产物纯化、克隆及序列测定:PCIi产物经0.75%琼脂糖凝胶电泳鉴定并按照胶回收试剂盒说明进行纯化将上述PCR回收产物和pcDNA3.0-Flag质粒用限制性内切酶BamH工和EcoRI双酶切,将产物经0.75%琼脂糖凝胶电泳后再次胶回收,用T4DNA连接酶将回收后的目的片段与载体16℃连接过夜将连接产物转化感受态细胞DHScx,取100闪涂在含有100mg/L氨节青霉素的1.B平板1r.37}C温箱培养0-16h,挑出单克隆抗性菌落接种于含有100m到L氨节青霉素的LB液体培养基中,370C振摇培养过夜,利用质粒提取试剂盒提取质粒,然后进行酶切和测序鉴定.　　4细胞培养及转染:取对数生长期细胞,按照3x10个/孔接种于6孔板培养Illl‘中,待细胞达到70%-80%覆盖率时开始转染~采用脂质体法按照助、-fectamine2000T0i说明书分别将pcDN.A3.0-Flag-RhoB重组质粒和空载体pcDNA3.0-Flag-}jOpti-1Tem混合制成转染液,最后按重组质粒组和空载体组将转染液分另{」加人6孔板中,未做任何处理的细胞作为阴性对照37℃孵育6h后更换成新鲜培养基.　　5.细胞RhoB蛋白表达的检测:将成功转染pcDNA3.0-Flag-RhoB的786-0细胞裂解,提取细胞总蛋白,经二唆琳甲酸(BCA)法蛋白定量,经十二烷基硫酸钠一聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳(12%分离胶、5%浓缩胶),蛋白上样量为50p,g,200rnA恒流转膜2h,经凝胶蛋白转移至聚偏氟乙烯(P}DF)膜用含5%脱脂奶粉室温封闭1h,后加人兔抗人RhoB一抗(1:1000稀释),4℃孵育过夜,TBST洗膜3次,加入羊抗兔二抗(1:3000稀释),室温孵育1h,TBST洗膜J次,膜与化学发光底物孵育5min,暗室中使X线片曝光、显影、定影.以转染空载体和正常786-0细胞作为阴性对照,内参抗体用卜8Ct111鼠抗人单克隆抗体,1:1}0}稀释使用.　　6.MT5法检测6细胞增殖:实验设重组质粒转染组、空载体组和未处理的阴性对照组,每组各设6个复孔,按照每孔X000个细胞密度接种于96孔板中,在37℃,5%C0,孵育24,48,72,96h后每孔加20p,1MTS溶液,继续培养2h酶标仪上选择490nm波长测定各孔吸光度(}a9o)值计算6孔平均值,以时间为横坐标八值为纵坐标绘制细胞生长曲线.　　7.细胞凋亡的检测:收集各组细胞,调整细胞密度至1x1了/L,加人5闪膜联蛋白V一异硫氰酸荧光素(Annexiny-FITC),室温避光孵育10min,加人5p,1碘化丙锭(PI)染色,随即进行流式细胞仪检测,观察凋亡细胞百分比.　　8.统计学方法:数据以均数士标准差表示,应用}PSS13.0统计软件分析,组间比较采用t检验.　　结果　　1.PCR获得RhoB全长基因:利用肾癌细胞株786-0rD\A,PCR方法打一增出RhoB的全长基因,经0.7}r}琼脂糖凝胶电泳分离后得到大小约600by的特异性单一条带(图1).　　2重组表达载体的鉴定:重组表达载体pcDN43.0-Flag-RhoB经BamITI和EcoRI双酶切后,0.75%琼脂糖凝胶电泳显示约600by左右的RhoB片段(图2)重组表达载体测序结果分析显示,所插人的序列与理论序列完全一致,证明RhoB真核表达载体构建成功.　　3.转染细胞中RhoB蛋白的表达:Westernblot检测阴性对照组、空载体组和重组质粒转染组的786-0细胞中RhoB蛋白的表达水平,见图3RhoB蛋白表达水平在转染重组质粒组明显高于阴性对照组和空载体组(P<0.O5).　　4.MTS法检测肾癌细胞786-0细胞增殖:3组细胞经培养后,可见RhoB对786-0细胞增殖有明显的抑制作用,转染重组质粒组对786-0细胞的增殖效应较空载体组和阴性对照组明显减缓(P<0.05),而空载体组和阴性对照组细胞增殖趋势差异无统计学意义(P>0.O5,表1).　　5.流式细胞仪分析细胞凋亡:转染重组基因组、空载体组和阴性对照组细胞凋亡率分别为(24.0}士0.60)%,(1.6i士0.30)%,(1.22士0.50)%转染质粒组细胞凋亡明显增加(P<0.05),而空载体组与阴性对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05).　　讨论　　Rho家族(RhoA,RhoR,RhoC)属于小分子C结合蛋白的Ras超家族,在细胞信号转导通路巾起重要作用,主要调节肌动蛋自细胞骨架重组、细胞私附和移动、胞内膜运输、基因转录、细胞周期、细胞凋亡等多种生理过程、Rho亚家族蛋白在多种恶性肿瘤中异常表达,通过多种信号转导通路,参与肿瘤发生发展过程的各个方面,目前Rh.家族与肿瘤的研究主要集中在肿瘤细胞生长和增殖、细胞凋亡、肿瘤浸润转移及肿瘤新生血管生成等多方面.研究结果显示RhoA和RhoC在大肠癌、胃癌、黑色素瘤及肝癌等多种恶性肿瘤中表达升高,参与肿瘤的侵袭及转移3-6.石铮等研究结果显示RhoC反义基因能够显著抑制人胆管癌QBC9}9细胞的增殖和侵袭能力.靶向抑制RhoA的表达和活性能有效逆转胃癌细胞的恶性表型,抑制其增殖和致瘤能力〔s.研究表明沉默RhoB的表达可通过磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路促进人支气管细胞的迁移和侵袭,而在未分化甲状腺癌中再激活RhoB的表达是抑制肿瘤生长的关键一步’.这些都说明RhoB在肿瘤的发生发展中作为抑癌基因发挥作用我们通过本实验成功构建pcDNA3.0-Flag-RhoB真核表达载体,并通过酶切和测序鉴定正确性)}\esternblot结果显示该载体能有效增强RhoB在细胞内的表达,从而有利于RhoB功能的研究我们进一步现察了RhoB对肾癌细胞786-0增殖和凋亡的影润,显示高表达RhoB可明显抑制肾癌细胞的生长速度.牛能显著增强细胞的凋亡效应,说明RhoB在肾癌的发生和发展中发挥负性调节作用,但具体分子机制还有待进一步研究.　　参考文献　　Etienne-Manneville S,Hall A. Rho GTPases in cell biology[J].Nature,2002.629-635.　　Ridley AJ. Rho proteins and cancer[J].Breast Cancer Research and Treatment,2004.13-19.　　Wang HB,Liu XP,Liang J. Expression of RhoA and RhoC in colorectal carcinoma and its relations with clinicopathological parameters[J].Clinical Chemistry and Laboratory Medicine,2009.811-817.　　Wang W,Wu F,Fang F. Inhibition of invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma cells via targeting RhoC in vitro and in vivo[J].Clinical Cancer Research,2008,(21):6804-6812.doi:10.1158/1078-0432.CCR-07-4820.　　石铮,郑岩松,曾金华. RhoC基因及蛋白在胃癌转移中的表达及意义[J].中华实验外科杂志,2002,(4):310-311.doi:10.3760/j.issn:1001-9030.2002.04.010.　　Boone B,Van Gele M,Lambert J. The role of RhoC in growth and metastatic capacity of melanoma[J].Journal of Cutaneous Pathology,2009.629-636.　　石铮,陈明流,何庆良. RhoC反义基因转染对人胆管癌QBC939细胞增殖和侵袭性的影响[J].中华实验外科杂志,2007,(1):53-54.doi:10.3760/j.issn:1001-9030.2007.01.021.　　Liu N,B i F,Pan Y. Reversal of the malignant phenotype of gastric cancer cells by inhibition of RhoA expression and activity[J].Clinical Cancer Research,2004.6239-6247.