Notch与磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路在膀胱癌的作用及其机制

已有研究表明Notch信号通路在膀肤癌中起重要作用,受体Notchl表达于患者预后相关’但是Notch信号通路在膀眺癌组织中的表达尚存在争议,对膀眺癌细胞增殖以及相关机制更是研究较少磷酸肌醇3激酶(PI3K)信号通路受各种生长因子及信号通路调控巨与细胞增殖密切相关u.本研究旨在观察Notch信号通路与PI3K/蛋白激酶B(Akt信号通路在膀眺癌中的表达与作用,探讨它们的作用关系.　　材料与方法　　1一般资料:收集福建省立医院2009年9月至2011年4月膀肤尿路上皮癌组织样本36例及其癌旁组织.于手术室内立即切下组织样本暂存于液氮罐中,之后保存于一80℃低温冰箱中瘤旁组织取自同一患者的远离癌组织5cm以上,外观正常的配对癌旁膀恍劲膜组织样本膀胧癌细胞株5637及T24细胞在含10%胎牛血清培养液中置于37℃培养箱中静置培养;(2S)-N-N-(3,5一二氟苯乙酞基)-L一丙氨酚-2-苯基甘氨酸叔丁酷(DAPT)及LY294002均购自SantaCruz公司,DAPT为Notch信号活化关键酶下内分泌酶的抑制剂.LY294002为PI3K特异性抑制剂,可以阻断PI3K的下游靶蛋白}4kt的磷酸化表达3_使用时,两者均溶解于二甲基亚矾(DMSO)中,使用浓度均为10mol/LJ.　　2.实时定量聚合酶链反应(Real-timePCR):使用J急RNA提取试剂盒提取总RNA后再利用第1链逆转录试剂盒逆转录为cDNA模板几定量PCR采用SYBRGreen染料法比较Ct值Notchl的引物为:正向:5'-TGCCAGACCAACATCAAC-3':反同:5'-CTCATAG'TC-CTCGGATTGC-3';Hesl的引物为:正同:}'-aTTC-CTCGTCCCCGGTGGCT-3’;反同:5’一CAGCTTGGAAT-GCCGCGAGCT-3';第10号染色体上缺失与张力蛋白同源的磷酸酷酶基因(PTEN)的引物为:正向:5'-CCACACGACGGGAAGACAAG-3';反向:5'-CCTCTG-GTCCTGGTATGAAGAATG-3';内参PPIA的引物为:正向:5'-TCATCTGCACTGCCAAGACTG-3';反向:5'-CATGCCTI'CTTTCACTTTGCC-3’　　3.Westernblot实验:RIPA裂解液提取组织及细胞蛋自,二喳琳甲酸(BCA)法检测蛋白浓度,经过电泳、转膜、封闭、孵育一抗和二抗等步骤之后增强化学发光(ECL)检测目的条带PTEN及磷酸化Akt抗体购自SantaCruz公司,一抗工作浓度1:200,内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为中杉金桥公司分装抗体,一抗工作浓度为I:1000,一抗4℃孵育过夜,二抗工作浓度为1:5000,室温孵育1h.　　4.MTS检测细胞增殖:使用MTS(3-(4,5-Dimeth-ylthiazol-2-yl)-5一(3-earboxymethoxyphenvl)-2一(4-sulfo-phenyl)-2H-tetrazolium)法检测干扰后细胞的增殖,按照试剂盒AQueousOneSolutionCellProliferationAssay(Promega公司)说明书操作,并在酶标仪(ELx800T",Biotech公司)读取490nm波长的吸光度(.4)值间接反映细胞数量,每组实验重复3次.　　5.统计学方法:应用SPSS13.0统计软件分析.数据以均数士标准差表示,两组之间正态数据比较采用t检验,非正态数据采用非参数检验.　　结果　　1.Notch信号通路在膀眺癌中呈活化状态:采用Real-timePCR检测36对膀胧癌组织中Notch信号通路主要受体Notchl及下游因子Hesl的mRNA表达,与瘤旁组织比较,肿瘤组织中Notchl受体升高(2.60士0.37)倍,Hes1升高(1.80士0.24)倍(P<0.05).　　2.PI3K信号通路在膀胧癌中呈活化状态(图1),PI3K信号通路也称PI3K/Akt信号通路,其活化的标志是磷酸化Akt表达水平升高,肿瘤组织中Akt的表达水平明显高于癌旁组织.　　3.Notch信号通路对膀脱癌细胞增殖的作用(图2):采用DAPT抑制Notch信号通路后,膀胧癌细胞1637和厂I"?4细胞增殖均受到抑制,说明'Votch信号通路在猪9}C癌中起促进细胞增殖的作用.　　4.PI3K信号通路对膀胧癌细胞增殖的作用(图3):采用LY294002抑制PI3K信号通路后观察其对膀胧癌细胞增殖的作用.采用LY294002抑制PI3K信号通路后,膀耽癌细胞5637和T24细胞增殖均受到抑制,说明PI3K信号通路在膀胧癌中也起促进细胞增殖的作用.　　5.Notch信号通路对PI3K信号通路影日问.Notch信号通路与PI3K信号通路在膀恍癌中表达均升高,且两者均有促进细胞增殖的作用,我们下一步将明确2条信号通路是否存在相互作用的关系采用DAPT抑制膀肤癌细胞Notch信号通路后,Hc}l下降(3.60士0.53)倍,PTEN表达下降(2.30土0.24)倍(P<0.OS,而Akt表达升高(图4),叮见,Notch信号通路可能通过调节PI3K来调节细胞增殖.　　讨论　　本研究结果表明,botch信号通路与PI3K信号通路在膀恍癌细胞增殖中起重要作用本研究未区分非浸润和浸润性膀眺癌,主要研究Notch信号通路在肿瘤发生中的作用,而且检测方法不一样,我们通过定量相对比较准确的Real-tithePCR方法可见Notch信号通路在膀眺癌中呈活化状态,抑制Notch信号通路后,膀恍癌细胞增殖受到抑制,说明Notcl:信号通路可能起促进肿瘤细胞增硫的作用I'I3It/Akt信号通路在多种人类肿瘤谱中表达失调,其异常活化使细胞异常增殖、分化、促进肿瘤生存,在胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、肝细胞癌、肾细胞癌中呈高表达45}本研究结果显示,PI3h信号通路关键因子磷酸化的Akt在膀肤癌中表达升高,这说明PI3K/Akt信号通路在膀眺癌发生过程中可能起重要作用再者帅瘤细饱失控性的增殖是肿瘤演进、侵袭和转移的基础和重要ij提}kt信号传导途径可通过多种途径促进肿瘤细胞周期进展,从而增强肿瘤细胞增殖能力.　　本研究结果显示,采用L}294002抑制I'I31t信号通路后,膀眺肿瘤细胞株增殖能力受到抑制,说明F'I_;h:'Aki信号通路在膀恍癌细胞增飨中同样起重要了乍FfI在叮.发牛过程中可能由于某些因子后信号通路激活而导致PI3IV厂Aht信号通路活化,从而促进肿瘤细胞增殖在膀恍癌中,我们发现与调节细胞增殖相关的Notcl:信号通路呈活化状态,而在急性T细胞淋巴白血病中,活化的Notcl:信号一通路通过下调抑癌因子F'Tk:N,而后者对Akt通路起负调控作用a,我们采用lOaPT抑制latch信号通路后,PTEN表达下降,而磷酸化lkt水平升高,听以,Notch信号通路正向调节I'I;Fs/Akt信号通路活化,促进膀服癌细胞增殖本研究结果表明,Notch信号通路与PI3h/Akt信号通路在膀眺癌中呈活化状态,Notch信号通路可能通过调节PI3K/Akt信号通路活化而促进膀肤癌细胞增殖,在膀眺癌发生过程中起重要作用.　　参考文献　　史涛坪,马鑫,傅斌. Notch信号通路基因在膀胱癌中的表达及其与预后的关系[J].中华实验外科杂志,2010,(9):1305-1307.doi:10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2010.09.046.　　Cantley LC. The phosphoinositide 3-kinase pathway[J].Science,2002,(5573):1655-1657.doi:10.1126/science.296.5573.1655.　　Gupta AK,Cerniglia GJ,Mick R. Radiation sensitization of human cancer cells in vivo by inhibiting the activity of pi3k using 1y294002[J].International Journal of Radiation Oncology,Biology,Physics,2003.846-853.　　王威,马鑫,朱捷. 肾透明细胞癌中pten/pi3k/akt信号通路的活性及其临床意义[J].中华实验外科杂志,2011,(5):768-770.doi:10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2011.05.043.　　陈正军,黄翔. Pi3k信号通路及其抑制剂抗恶性肿瘤的研究进展[J].实用医院临床杂志,2011,(3):140-143.doi:10.3969/j.issn.1672-6170.2011.03.066.　　Palomero T,Dominguez M,Ferrando AA. The role of the pten/akt pathway in notchl-induced leukemia[J].Cell Cycle,2008.965-970.