人膀胱移行细胞癌上皮间质转化与核转录因子叉头框蛋白Q1的关系

上皮间质转化(E':lt'1,)系指上皮细胞在特定的生理和病理情况下向间充质细胞转化的现象,EMT被认为是参与肿瘤浸润转移的关键启动步骤】有研究表明叉头框(FOX)家族成员参与[皮细胞极性的调控,在人乳腺癌细胞中,转化生长因子(TGF)一田调控转录因子又头框蛋白Q1(FOXQ1)的活性,FOXQ1表达上调抑制E一钙钻蛋白(E-cadherin)的转录从而启动Ia'!9'1.,最终促进肿瘤的侵袭转移,FOXQ1是FOX基因家族中又一与肿瘤密切相关的重要成员2我们以膀恍移行细胞癌(BTCC)为研究对象,通过分析1'GF'-p1,F(少XQ1及EM1'标志物E-cadherin和波形蛋白(VimerEtin)的表达差异和相关性,探讨转录因子FOXQ1与膀肤移行细胞癌EMT的关系及在膀肤癌浸润转移中的作用.　　资料与方法　　1.一般资料:收集武汉协和医院2009年9月至2011年9月手术切除并经病理证实的膀恍移行细胞癌组织标本65例,每例标本均选用癌组织中心、癌旁组织距癌灶1orn处,以及正常膀眺乳膜组织远离癌灶5cm处作为对照其中男40例,女25例中位年龄62.5岁(28一83岁工按2004年\\HO/1sUP修汀的膀眺癌病理分级标准:低度恶性倾}司尿路上皮乳头状瘤(LMP)18例,低分级尿路L}皮癌(LG)27例,高分级尿路上皮癌(HG)20例.按2002年[1CC的临床'1'NI}}T分期:浅表性癌(XMIBC:)、一『T1期为}8例,叭层浸润性癌(M1BC)T2--T4期为37例各例长,均未接受化疗和放疗及免1度治疗i;F例卜仁叹于-80℃冻存用以分子生物学检测暇,IUC}福马林固定,常规石蜡包埋,厚3p,m切片用以免安组织化学检测Trizol试剂购自lnvitroge.公司;Revert-}id}}}FirstStrandeDNA5vnthesi、和聚合酶链反应(PLR)试剂盒购自大连宝生物(TahaRa)工程有限公司;PCR打‘增引物采用Primerpremier5.0设l十,由Invitrogen公司合成}'esternblot所用FOXQ1多克隆抗体购自Abcam公司,TGF-团单克隆抗体、E-cadlre1单克隆抗体和Vimentin单克隆抗体购目(:ellSignal公司,甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)单克隆抗体购自SantaCruz公司;免疫组织化学染色采用链霉素一生物素过氧化物酶法(SP)试剂盒及二氨基联苯胺(DAB)均购自北京中山生物技术有限公司,增强化学发光(ECL)染料购自Pieree公司,蛋白标准品购自Sigma公司其他生化试剂采用国产分析纯.　　2.逆转录(RT)-PCR检测核转录因子FOXQI,TGF-(31,E-cadherin,Vimentin基}k[mRNA在各例膀恍癌组织(浅表性癌和7rJ层浸闰性癌)、癌旁组织以及远端正常膀眺就膜组织fi}J表,-按Tl'1ZOl}}\}试剂说明书分别提取各例样本L.RBA.使明逆转录试剂盒制备eD1'A第1链用Primerpremier软件设计PCR扩增引物序列:FOXQ1(上游引物:5'-A1TI'CTTGCTATT-GACCGATGC-3',下游引物:5'-CCCAAGGAGACCA-CAGTTAGAG-3’)、TGF-(31(上游弓.刃:;’--1ACCCA-CAACGAAATCTA-3',下游引物:5’一丁(二}u}GTATCGC-CALGAAT-3'),E-cadherin(上游引牡:5’一}aCGCAT-TGCCACATACAC-3',下游引物:j’一《}W-;CACCTTC-CATGACAG.AC-3’)、`'imentin(__丘游引石:;’一}CAG-GCTTTAGCGAGTTATT-3',下游引物:5‘一(}-}GCTC-CTAGCGGTTTAG-3'),GAPDH(上游弓{扛:5':5-c_;G丁-GAAGGTCGGAGTCAACGG-3',下游引物:5'_}_:i丁C-GAAGATGGTGATGGGATT-3’)PCR反应性票:cDXA1Nl,几游引物1林1,下游引物1林1,Jlixl})}I.H,012闪,总体积25闪,内参相同反应条件:}}-I顶变除5min,35个循环(94℃变性30s,55一60U火30s,72℃延伸30s)后72℃再延伸7min终止反应PCI}产物经1.}%琼脂糖凝胶电泳,MGIAS1000凝胶成像系统扫描定量并拍照.　　3.Western blot检测核转录因子FOXQ1,TGF-(31,E-cadherin,Vimcntin蛋白在不同分期膀眺癌组织中的表达:按Pierce蛋白裂解液操作流程提取膀恍癌组织(浅表性癌和肌层浸润性癌)、癌旁组织以及远端正常磅眺郭膜组织总蛋白二峰琳甲酸(BCA)法对蛋白进行定量,十二烷基硫酸钠一聚丙烯酸胺凝胶电泳(SI>S-PAGE)分离,转染硝酸纤维膜5}Ir脱脂奶粉封闭,分别加一抗(兔抗人TGF-(31、兔抗人FOXQ1、兔抗人E一(a}lherio、兔抗人Vimentin),二抗为辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG,ECL发光系统显示蛋白质表达以G,APDH为内参照,应用L'VP凝胶成像系统扫描蛋自条带,采用BandScan进行吸光度(A)值分析.　　4免疫组织化学方法检测FOXQ1,TGF-(31,E-cadherin,Vimentin在正常膀恍勃膜组织和膀胧癌组织的蛋自表达:采用SP法,抗体的工作浓度分别为1:200,1:200,1:100,1:100,DAB显色,苏木素复染,中性树脂封固磷酸盐缓冲液(PBS)取代一抗作阴性对照结果判定:FOXQ1以细胞核出现棕黄色颗粒为阳性,TGF'-(31以细胞质及细胞间质内出现棕黄色颗粒为阳性,E-cadherin以细胞膜及少许细胞质出现棕黄色颗粒为阳性,Vimentin以细胞质出现棕黄色颗粒为阳性判断标准是每张切片随机选取5个高倍视野(x400),每个视野计数100个细胞,先按阳性细胞所占百分比评分:<5%为0分,6%一25%为1分,26%一50%为2分,51%一75%为3分,)76%为4分;再按染色强度评分:不着色为0分,淡黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分最后按两者乘积数将各个标本的表达强度分为4个等级:阴性(一)1级(0}2分);弱阳性(+)2级(3一5分);中度阳性(++)3级(6一g分);强le性(+++j4级(9一12分).　　5.统计学方法:应用SPSS16.0统计软件分析阳性表达率之间的比较采用t检验,多组间比较用方差分析,采用Kendall等级相关分析.　　结果　　1.FOXQ1,TGF-(31,E一(adherin、Vimentin的niRXA和蛋白在正常膀眺组织、癌旁组织、浅表性癌、肌层浸润性癌中表达:RT-PCR结果显示,以G}PDH为内参对照,FOXQ1与TGF-}31,Vimentin基因在膀恍癌中的mRNA表达明显高于正常膀胧茹膜组织,随着恶性程度增高,表达趋势呈规律性的增强;而E-cadherin在膀眺癌中的表达明显低于正常膀胧载膜组织,随着恶性程度增高,表达趋势呈规律性的减弱以GaPDH为内参,FOXQ1,TGF-(31,Vimentin在不同组织中的表达差异有统计学意义(P}O.O5,图1};,FOXQI在浅表性癌低于肌层浸润性癌的表达,与免疫组织化学结果一致Westernblot结果与RT'-PCR结果相符,FOXQ1,TGF-X31,Vimentin蛋白在膀肤癌中的表达明显高于正常膀胧茹膜组织,肌层浸润性癌表达最高:而E-cadherin在膀眺癌中的表达明显减弱甚至不表达,随恶性程度增高呈规律性的减弱(图1B).　　2.FOXQ1,TGF-(31,E-cadherin,Vimentin蛋自在膀肤移行细胞癌组织中的表达及与临床病理特征的关系(表1);65例BTCC组织中的FOXQl,TGF-(31,Vimentin阳性表达率明显高于正常膀胧戮膜组织(89.2%比13.8%、76.9%比26.2%和83.1%比20.0%,P<0.05),随着膀胧癌的病理分级及临床分期的增高,FOXQl,TGF-(31,Z'imentin的表达率逐渐升高,FOXQ1阳性染色定位于细胞核,且FOXQ1表达与肿瘤分化程度、肿瘤浸润深度及淋巴结转移有关(P<0.05)E-cadherin在膀胧癌组织中的阳性染色定位于细胞膜,E-cadherin在膀恍癌和正常膀恍组织的阳性表达率差异有统计学意义(27.7%比89.2%,P<0.05).随着膀恍癌的病理分级和临床分期的升高,E-cadherin的表达率逐渐降低、Vimentin在膀胧癌组织中定位.　　结论核转录因子FOXQ1与膀胱移行细胞癌分化和转移有关,可能通过调控EMT来促进膀胱移行细胞癌的侵袭转移.　　参考文献　　Thiery JP,Acloque H,Huang RY. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease[J].Cell,2009.871-890.　　Feuerborn A,Srivastava PK,Küffer S. The Forkhead factor FoxQ1 influences epithelial differentiation[J].Journal of Cellular Physiology,2011.710-719.　　王洪涛,陈杰,张战凤. 转化生长因子-βl对体外培养的人毛囊干细胞生物学特性的影响[J].中华实验外科杂志,2010,(12):1862-1864.doi:10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2010.12.033.　　阮黎,张旭,马鑫. 膀胱移行细胞癌E-钙粘连素基因启动子C/A单核苷酸多态性与肿瘤复发的关系[J].中华实验外科杂志,2005,(1):9-11.doi:10.3760/j.issn:1001-9030.2005.01.003.　　王智宇,曾甫清,朱朝辉. 胸腺素α4基因沉默对膀胱移行细胞癌上皮间质转化的逆转作用[J].中华实验外科杂志,2010.501-503.