京尼平特异性抑制线粒体解偶联蛋白2对肾癌细胞抑制作用的研究

由于临床上肾癌对放、化疗均不敏感,并且其发病率逐年升高E1□,近年来围绕肾癌的各种生物学、免疫、靶向治疗研究虽取得了一定成果,但疗效并不令人满意。解偶联蛋白2(uncouplillg protein2,UCP2)是定位于线粒体内膜上的一种载体蛋白Edl,具有调节细胞能量代谢、调控活性氧含量(ROS)的功能,因其在不同组织中表达和功能的差异,近年来成为研究热点。研究发现,UCP2在肺癌、肝癌等多种肿瘤组织中表达增高,与肿瘤的发生、发展过程有密切关联。CY Zhallg等发现,京尼平(gel.ipin)可作为UCP2特异性抑制剂E5明。而genipin存在于栀子、杜仲等我国多产植物中,具有抗炎、抗肿瘤、降糖、保肝利胆、抗高血压、保护神经细胞等作用,作为一种更为经济、安全、有效的药物应用于肾癌的治疗研究有较重大意义。本研究通过用不同剂量geniP in干预肾癌细胞(GRC D,并观察细胞生长情况和UCP2的表达,探讨genipin对肾癌是否具有治疗作用及其对UCP2的影响。

1材料与方法

1.1材料与试剂GRC1购自上海弗雷堡生物公司。genipin购自临川之信生物科技有限公司,分子式C11H14O5,CAS号6902-778,本品为白色结晶粉末(纯度≥98%)溶于二甲基亚砜,避光4·C保存。MTT购自Sigma公司。RIMP1640购自Hrlone公司。胎牛血清购自杭州四季青公司。逆转试剂盒购自In-vitrogen公司。PCR MasterMix购自Fermentas公司。UCP2Elisa试剂盒购自R&D公司。

1.2细胞干预及分组人类肾癌细胞株GRG1于5%CO2、37℃条件下培养,培养基为含有10%胎牛血清和1%青霉素、链霉素的RIPM16奎0。细胞种板后,生长至汇合度达70%~80%后更换无血清培养基,分别使用低、中、高三种浓度(40 umoI/L、80 umol/L、120umol/L)的genipin浸染细胞培养基对GRC1进行干预,相应分为低、中、高剂量组,并设对照组。

1.3 MTT法检测京尼平对细胞生长的作用细胞接种于96孔板中,104个/孔,培养24h后用含高、中、低三种浓度genipin的无血清培养基进行干预,每组复孔6个,干预时间为48h。小心吸取孔内培养基,每孔加入80uL无血清培养基和⒛uL MTT溶液(5ug/L),继续培养4h。小心吸取孔内液体,每孔加人150uL二甲基亚砜,摇床上震荡10min,待蓝紫色结晶充分溶解后用酶标仪检测490nm处的OD值,并根据下列公式计算:细胞抑制率(%)=E(对照组oD值一调零孔OD值)—(干预组OD值一调零孔OD值)]/(对照组oD值—调零孔OD值)×100%。

1.4 RT PCR检测细胞UCP2mRNA的表达量使用总RNA提取试剂盒提取GRG1细胞总RNA,使用分光光度计和凝胶电泳检测RNA的浓度与完整性,取1帽进行逆转,合成cDNA后行PCR反应。引物序歹刂:阡actin:正向:5′CCCTGGACT-TCGAGCAAGAGA卜3′,反向:5′γ啾GGT-GACGAAC用℃ACCACG3′,退火温度53C;UC△:正向:5′-GACC7FGACCTC盯CAAGG-3′,反向:5′GTTTTCTGCGCAAGTT~KGG3′,退火温度56C。R⒎PCR反应条件:预变性94C3min,变性94C30s,55C30s,72C1min,72C5min,35个循环,以⒏acun作为内参照。所得PCR产物于2%琼脂糖凝胶进行电泳分析。

1,5荧光探针检测细胞内ROS含量培养细胞至汇合度为80%时,三种浓度genipin与细胞作用48h后消化成细胞悬液,1000rpm离心5min;弃上清,1mL稀释好的DCFH-DA重悬细胞。使DCFH-DA终浓度为10umol/L,于37C培养箱中孵育⒛min。每隔3~5min颠倒混匀一下。探针孵育结束后,用无血清细胞培养液洗涤细胞三次,3mL PBS重悬细胞,荧光分光光度计测定DCF的荧光强度。检测条件:激发波长488nm,发射波长525nm,激发和发射波长的光栅宽度均为5nm。

1.6统计学处理所有数据采用SPSS19统计学软件分析,计量资料以万±s表示,组间均数采用单因素方差分析,P<0,05示差异有统计学意义。

2结果

2.1不同浓度genipin对GRC1细胞增殖的影响三种剂量genipin干预肾癌细胞48h后,经检测,低剂量组与对照组OD值比较差异无统计学意义(P)0.05),中、高浓度组细胞增殖均被抑制,OD值与对照组相比差异有显著性(P(0.005)。行组间两两比较,除对照组与低浓度组外,其余各组差异均有非常显著性(P<0.001),提示细胞抑制率随着给药浓度增加而逐渐升高,即随着给药浓度的增加,治疗作用逐渐增强。见表1。1后UCP2的基因表达随着给药浓度的增高,u'2的表达逐渐减低。与对照组相比,低、中剂量组未出现明显减低(P>0.05),在高剂量组则出现显著减低(P<0.05)。见图l。

2,3 genipin干预后GRG1内ROS的含量ROS含量用荧光分光光度计测定荧光强度。随着给药浓度的增高,GRC1内ROS含量逐渐增加。与对照组相比,低剂量组GRG1内ROS含量虽出现升高趋势,但差异无统计学意义(P)0.05);中、高剂量组细胞内ROS含量较之相应对照组显著增高(P(0.05)。见表2。

3讨论

中药因其资源丰富且副反应小,已越来越广泛地被应用于抗肿瘤药物的研究中,并展示出广阔的前景。genipin作为一种中药提纯物已被证实具有抗肿瘤作用,genipin对肾癌的治疗作用及其作用机制目前国内外尚无报道。genipin是UCP2的特异性阻断剂[⒌6],ucP2是线粒体内膜上的一种蛋白,它的调节能够从多种途径减缓甚至抑制细胞的凋亡和线粒体的损伤。线粒体作为真核细胞中一种重要的细胞器,在肿瘤的发生发展过程中扮演了重要角色。所以本实验将genipin和UCP2一起并人研究对象,从线粒体层面对genipin对肾癌的作用机制进行初步研究,以期探寻一种更为经济安全有效的药物,拓展肾癌的基础研究领域并开辟肾癌治疗的新途径.

实验结果显示对肾癌细胞给予不同浓度的ge-血pin干预后,随着给药浓度的升高,GRC1的生长逐渐受到抑制,在中、高剂量组出现了明显抑制,即随着给药浓度的增加,genipin对GRC-1治疗作用逐渐增强。说明体外实验中莎nipin对肾癌细胞具有抑制作用。R孓PCR检测细胞UCP2mRNA的表达量,随着genipin给药浓度的增加,UCP2的表达逐渐下调,亦在中、高剂量组出现了显著变化,其表达趋势与MTT检查结果相互一致。提示genipin对肾癌细胞的抑制作用可能是通过对UCP2的特异性抑制,即通过特异性阻断UCP2的表达来影响其抑制肿瘤细胞凋亡的作用。检测genipin干预后ROS含量进一步印证了UCP2表达下调的实验结果。

解偶联蛋白(uncoupling proteins,UCPs)是一种质子转运蛋白,其本质是线粒体内膜上的H+通道,能影响线粒体跨膜电位。在已发现的UCPs五种亚型中,UCP2在成人体内广泛分布于心、肾、脾、胰岛以及脑组织、淋巴结等处。UCP2存在于线粒体内膜,定位于11号染色体(11q13)上,基因全长8.4kb,有8个外显子。它的调节能够从多种途径减缓甚至抑制细胞的凋亡和线粒体的损伤[7]。其过表达与肿瘤适应性机制的形成有关[I叫。UCP2表达可减少ROS的形成,减少ROS对组织细胞的伤害,抑制ROS介导的线粒体途径的细胞凋亡发生。所以我们推测genipin抑制UCP2的表达,ROS平衡被打破,从而导致肾癌细胞发生凋亡[12]。这与实验中genipin抑制UCP2表达,ROS升高而肾癌细胞生长抑制的结果相一致。Dalla PE等[13]报道了genipin特异性阻断UCP2协同吉西他滨抑制癌细胞增殖的作用。而本实验结果提示:在体外实验中genipin本身对肾癌细胞就有较为明显的抑制作用,该抑制作用可能与gellipin特异性阻断UCP2的表达有关。但本实验尚不能说明genipin阻断UCP2对肾癌细胞的抑制作用是具体通过哪种途径来实现的,还需在下一步的实验中检测线粒体相关指标,以深人探讨genipin特异性阻断UCP2对肾癌细胞治疗的具体作用。

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