FISH技术在膀胱癌TURBT术后的诊断价值研究

经尿道膀胱肿瘤切除术(TURBT)适于治疗早期的膀胱浅表肿瘤,具有损伤小、疗效显著的特点。然而,此类患者的术后复发常成为治疗失败的主要原因之一。传统的术后监测手段主要为定期的膀胱镜及尿脱落细胞形态学检查。但TURBT术后患者常接受定期而规律的膀胱灌洗治疗,常用的膀胱灌洗药物诸如卡介苗、吡柔比星、羟基喜树碱等均会引起不同程度的化学性炎症,从而导致从肉眼水平与细胞形态学水平方面的不同程度改变,这些改变与浅表性肿瘤的复发难以区分,导致膀胱镜及尿脱落细胞复检的准确性明显降低[3]。因此,我们选用多靶荧光原位杂交技术(ΠSH)对58例膀胱癌TURBT术后患者进行多时间点持续监测,并同时与膀胱镜及尿脱落细胞进行比较,以探讨其在膀胱癌TURBT术后的诊断价值。

1 资料与方法

1,1患者资料

收集我院2009年1月至2012年1月膀胱癌TURBT术后患者58例,术后12个月内每3个月予患者行FISH、膀胱镜、尿脱落细胞检查。患者的中位随访时间为18个月(12~24个月)。阴性对照组取自健康志愿者及非尿路上皮癌患者尿液。其中,健康志愿者15人,另5例为肉眼血尿或/和镜下血尿,经B超、IVU、CT及膀胱镜确诊为非尿路上皮肿瘤患者。患者TURBT术后首次出现细胞学、FISH、膀胱镜的任何一种检查异常均视作随诊观察的起始时间点。患者出现复发证据的时间则作为终末时间点(膀胱镜及尿脱落细胞形态学检查)。

1.2 FISH检测

1,2.1标本收集对于可自行排尿的患者,连续3d留取晨尿200mL,1h内送检处理。不能自行排尿者,则通过膀胱穿刺及导尿管取尿。

1.2.2标本预处理离心尿液,吹打并孵育悬浮细胞,2XSSC(pH7,0)溶液漂洗玻片,置于37C胃蛋白酶溶液中浸泡,乙醇脱水后自然干燥玻片,并加热玻片至56C。

1.2.3标本准各及变性将玻片在变性液中浸泡,梯度脱水。玻片自然干燥后与探针杂交。所有探针均购自北京金菩嘉医疗科技有限公司。将F⒙H探针变性,将其置于45~50C水浴箱中。

1.2.4观察与图片处理探针与样本杂交后洗涤玻片,暗处自然干燥。DAPI复染杂交区域,荧光显微镜下观察DA2、PI、FITC和CY3的荧光信号并收集相关图像。每张玻片计100个细胞,每个细胞分别登记该组两种探针信号数目,并统计信号种类(1个信号点、2个信号点、3个信号点和其他信号点)与相对应细胞数目的百分比。用20例泌尿系良性疾病患者的结果建立阈值(阈值=平均值+3×标准差),根据阈值对每例标本探针进行定性。如检测值大于阈值,则判定为阳性结果;小于阈值,判定为阴性结果;等于阈值,则加大观察样本的细胞数目。计数结果由两人独立完成,结果一致方可认定。

1.3统计学处理采用∏sher EⅫct Test、T test对FISH及膀胱镜、尿脱落细胞检出率、检出时间进行比较。P<0,05视为差异有统计学意义。

2结果

2.1患者临床特征比较本研究中共有58例患者接受TURBT。其中,分级主要集中于G2(40.17%),约半数患者分期为T2.(54.70%)。TURBT术后随访阶段,共有13例(22,22%)患者失随访或其随访期间所得数据不能用于统计分析。剩余的45例(77.78%)接受TURBT的长期随访患者中,大部分患者(76,92%)为男性,标本采集来源主要为患者自行排尿收集(81,32%)。

2.2正常阈值建立对照组尿液样本FISH检测阈值见表1。对照组尿液样本FISH检测信号图见图1。

2.3随访结果本研究分别统计了尿脱落细胞形态学、FISH、膀胱镜对45例患者的结果(图2)。结果表明,45例患者中-通过尿脱落细胞形态学及膀胱镜判定共有5例(11.11%)为复发。而ΠSH检测结果表明:45例患者中,共有例(28.88%)次TURBT术后尿脱落细胞FISH检测为阳性。通过尿脱落细胞形态学及膀胱镜判定复发的5例中,仅1例在术后第一次复检时即获诊断;其余4例中,1例为术后6个月、1例为术后12个月、2例为术后15~24个月复发,平均复发时间(膀胱镜镜检阳性)为(15.33±5.5o)个月。而FISH检测阳性的13例中,术后3个月检测45人,阳性者0例;术后6个月检测狃人,阳性者3例;术后9个月检测43人,阳性者6例;术后12个月检测43人,阳性者8例。在此13例次∏SH阳性患者中,4例2年内复发,2年复发率为30.77%;其中,有2例患者连续3次FISH阳性,在此2例FISH检测持续阳性的患者中,2年内均全部复发(见图2);而FISH连续检测2次阳性患者4例,2例在2年内复发,2年复发率50.0O%;FISH检测持续阴性者29例,2年内仅1例复发,2年复发率3.45%。FISH阳性的平均检测时间为(9.92±2,24)个月。检验表明FISH阳性的平均检测时间低于膀胱镜镜检阳性时间(P<0.05)。Fisher Exact test比较表明:膀胱镜及尿脱落细胞形态学阴性而FISH阳性的患者中,复发率明显高于膀胱镜、尿脱落细胞形态学及FISH均为阴性的患者(P<0.05)。

3讨论

我国尿路上皮肿瘤以膀胱癌最为常见,发病率和死亡率均呈逐年上升趋势E4]。细胞形态学检测及膀胱镜检查是诊断膀胱癌普遍使用的两种手段。但尿脱落细胞检查容易受到结石、炎症等因素的影响而出现假阳性结果,而膀胱镜有创检查患者痛苦较大且对于微小扁平肿瘤容易造成漏诊[5]。既往研究证实并肯定了FISH检测技术在膀胱尿路上皮肿瘤中的诊断及应用价值,但对于其用于监测治疗后疗效及复发的报道则相对较少。本研究结早表明:TURBT术后12个月内对患者进行次/3个月的FISH尿脱落细胞检测有助于术后膀胱癌复发的监测及早期评估。本资料中,FISH的阳性表现早于尿脱落细胞及膀胱镜细胞形态学改变。此外,FISH阳性者复发率明显高于FISH阴性的患者,尤其是对于连续2次或以上F⒔H持续阳性的患者,应高度警惕其远期复发的可能。由于TURBT术后的常规抗复发治疗所致的炎性反应对膀胱镜、尿脱落细胞形态学的干扰,FISH的优势显露无疑。本研究中945f9ll TURBT术后患者的平均复发时间多为1年后。然而,TURBT术后的肿瘤患者健康状况多不佳,且有创性检测有可能导致炎症、术中及术后出血,痛苦较大。因此,多次膀胱镜的有创性检测对于此类患者而言,其安全性、可行性有待商榷。而尿脱落细胞检查其特异性低于膀胱镜,尤其是膀胱灌洗对其结果易造成干扰,因此FISH作为一种灵敏、特异性高、无创性检查手段,冥具有应用、诊断方面的优势及价值。尽管邱晓拂等通过Kappa一致性比较认为FISH与膀胱镜的一致性一般,不能用以替代膀胱镜检测,但本研究结果表明FISH检测可早于膀胱镜对TURBT术后患者的复发进行预估并进行针对性治疗;即使不能替代膀胱镜检测,但作为术后的有效监测手段,ΠSH在应用性、安全性方面均优于膀胱镜检测。本研究发现随着术后监测时间的延长,FISH阳性率明显递增。而术后3个月FISH阳性率为0%。此结果与之前的研究结果类似。因此,我们建议对于TURBT术后的患者,应从术后半年起即进行次/3个月的FISH监测,并在连续2次或以上出现阳性改变后进行膀胱镜检查,有助于术后膀胱癌复发的监测及评估,并尽早给予针对性治疗。该方法安全、灵敏,值得推广。

参考文献

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