富集兔毛囊干细胞构建组织工程化尿道的研究

组织工程技术修复尿道缺损的技术已较为成熟。口腔薪膜细胞，包皮表皮细胞都被成功用于构建组织工程尿道，成功修复尿道缺损[1-3]。毛囊干细胞一次性分离获取的数量较少，但其增殖分化能力强，至今毛囊干细胞用于构建组织工程尿道并修复尿道缺损的报道尚少，本研究拟探索分离培养毛囊干细胞后，经过丙次富集构建组织工程尿道修复兔尿道缺损的可行性。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物2月龄新西兰兔10只，雄性，体质量2. 7 --3. 2 kg,由中山大学实验动物中心提供实验动物生产许可证号码为SCXI(粤)2004一0011，使用许可证号码为SI'XK(粤)2007一0081 1.1.2主要试剂和仪器0. 05%胰蛋白酶(Gihco ) ; 0.53 mmol/L乙二胺四乙酸(LDTA ) ( ln}Titrogen ) ; Disease }j ( Roche) ; FITC标记CD71鼠来源单抗、PI} 标记Integrin 6鼠来源单抗、Ki9、p63、β1-integrin、 AE 1 /AE3小鼠来源单抗和l' H:标记抗鼠抗体(Santa Cruz) ;Epic;a Altra流式细胞仪(Beckman Coulter).

1.2方法

1.2.1毛囊干细胞的分离和坑养将实验动物肺醉后，于无菌条件下使用乎术刀切取兔双侧包含触须的全层皮肤约0. 3 crn x 1. 2 cm将切取下来的织织置十氯霉素注射液中浸泡5 min再川})盯冲洗5 遍，钝性方法分离一单个毛囊组织单个毛囊组织被采用“两步酶”法“}获取细胞，将消化后的细胞以 2. 5 x 108 /浓度接种到培养瓶中.在5% CO2 . 37℃ 饱和湿度培养箱中进行培养、被培养的细胞每3 d 换液一次，当细胞融合达到80%左右},1.按1:3比例传代培养。 1.2.2流式细胞仪分选富集毛囊干细胞PBS冲洗培养瓶，0. O5 %胰蛋H酶一0. 53 mmol/I, LDTA作用培养的毛囊细胞，PBS清洗，1 000 r/min离心5 min二利用流式细胞仪，分选同时满足Tntegrin 6+/CD71 且直径< 10 pm的细胞群.

1.3免疫荧光法检测毛囊干细胞标志物表达 制备细胞爬片，采用免疫荧光方法分别检测玻片细胞角蛋白]9 , p63和p，整合素的表达;角蛋自19 抗体(1:50 ) , p63抗体(1:50) ,整合素抗体(1:100) 分别作用不同细胞爬片，4℃冰箱过夜，PL;标记抗鼠抗体(I:50)，荧光显微镜下观察并拍照

1.4构建组织工程化尿道组织

1.4.1膀胧脱细胞基质支架材料制备切取实验兔膀肤，生理盐水冲净血迹，将兔膀胧组织置于 10 mmol儿PIS S(pH 7. 0)与0. 1%叠氮钠(Merck，德国)的混合溶液中浸泡搅拌过夜，以0. 4 070胰蛋白酶 (Gibco)于37℃下消化5 h,0.2%戊二醛交联保护 10 anin,40 kU/LDNA酶(Sigma ) 37℃下浸泡搅拌 8 h, 4%脱氧胆酸钠(Sigma)和0 . 1 0lo叠氮钠溶液中搅拌6h，反复漂洗，冷冻干燥后封装，环氧乙烷消毒，保存备用。 1.4.2以细胞一材料复合物构建组织工程化尿道组织收集经流式细胞仪分选富集的毛囊干细胞，按1 x 10y/ L的密度滴注在膀恍脱细胞基质支架材料上，置培养箱中，在5% CO2 . 37℃和饱和湿度条件下培养24 h，再将细胞一材料复合物置于I}SF }-1音养液中挤养1周，然后改用气液交界( air-liquid infer- face培养1周扫描电子显微镜观察 1.5动物实验 手术分离实验兔前尿道补膜(约2. 5cm)，将组织工程化尿道组织接种细胞面朝内包裹于8F导尿管上.用9一0可吸收缝线固定成管状，植入尿道缺损部位，同时一以9一0可吸收线固定l实验组,n =5) 以单纯膀眺脱细胞基质材料修复尿道缺损作为对照组(n)术后两组动物均给予抗厂卜索预防感染. 庆大霖素（8万U)加人牛理盐水(3 mL}稀释后经耳绿静脉注射，1次/d分别于尿道缺损修复后1 ,3个月分批处死动物，采集井制备尿道钻膜修复区组织标刁、J序才、精一伊红(IIF)染色光学显微镜下观察组织学改变免疫组织化学法检测尿道黏膜上皮细胞 AE1/AE3的农达情况洲包质染色呈现棕黄色)一选取尿道缺损修复后3个月的实验兔，于处死前进行尿道造影检查，观察尿道通畅情况。

2结果

2. 1体外分离培养的毛囊干细胞的形态学观察 光学显微镜观察发现，分离培养的毛囊干细胞呈现!_皮细胞形态，随着细胞培养时间的延长细胞数量逐渐增多(图I).

2. 2富集毛囊干细胞K1 9 , p63和β1整合素的表达 免疫荧光检测结果显示:经流式细胞仪分选富集的毛囊干细胞KI9 ,p63和日，整合索农达阳性(图2)

2. 3由细胞一材料复合物构建的组织i.程化尿道组织的结构 扫描电子显微镜观察发现，细胞与支架紧密贴附，细胞与细胞排列紧密，伸展适度并有基质分泌，符合上皮组织的形态学特征(图3). 2. 4兔尿道缺损修复情况

2. 4. 1组织学改变HE染色光学显微镜观察发现，毛囊干细胞形成复层上皮结构;与修复后1个月时比较，修复后3个月时的缺损修复区域尿，道黏膜下层内细胞数量显著增多(图4). 2. 4. 2蒲膜上皮细胞AE1/AE3的表达免疫组织化学检测结果显示:尿道缺损修复后1,3个月时，修复区域钻膜上皮细胞AEl / AE3染色均为阳性(图5). 2. 4. 3 尿道造影情况兔尿道修复缺损修复后3 个月后的尿道造影结果显示，实验组尿道平滑通畅，对照组尿道呈现狭窄部分畅通(图6).

3讨论

傅强等[1]首先报道利用兔包皮来源的表皮细胞接种到脱细胞基质，并成功修复兔尿道3 cm的缺损。口腔载膜细胞也被用于兔尿道缺损的修复，并取得成功[2,3]。但无论是表皮细胞还是口腔勃膜细胞都有局限性。因为如果要获得足够数量的种子细胞，必须要切取相应面积的皮肤一与口腔勃膜组织，这就可能造成新的组织缺损。新的种子细胞还在不断探索中。杨青等[5]比较了体外培养表皮干细胞和毛囊干细胞的生物学特性，发现二者均可作为皮肤组织工程化种子细胞，毛囊干细胞较表皮十细胞贴壁快，具有更高的增殖活性。因此，毛囊干细胞的优势更为显著[6]。本研究采用兔毛囊干细胞构建组织」_程化尿道，毛囊干细胞虽然具有较高的增殖活性，但含量很低[7]，因此，本研究利用流式细胞仪多参数分选提高毛囊干细胞的比例。细胞直径参数曾被用于十细胞的分选指标，小直径细胞群中干细胞的数量明显多于大自_径细胞群中的干细胞数量[7].integrin- a6+/cd71-也被报道是表皮干细胞分选指标之一，但尚未见应用细胞直径与integrin- a6+/cd71-同时分选毛囊干细胞的研究报道。分选后细胞K19,p63, β1 -intearin的表达阳性率高，进而验证了多参数分选富集毛囊干细胞方法的有效性。

毛囊来源的干细胞虽然来源于毛囊，但是不会形成毛囊。实验研究证实，毛囊十细胞在体外构建组织时形成表皮组织}}70环境对细胞有明显的诱导作用，表皮细胞在赫膜细胞生长的环境中向私膜组织分化。同样，薪膜细胞在表皮细胞生长环境中也向表皮组织分化。本研究发现，毛囊干细胞能够形成复层上皮结构且AEl/AE3染色阳性，进一步证实其性质为上皮组织。同时尿道缺损修复后3个月时的豁膜下层内细胞数量多于修复后1个月时，提示组织工程化尿道促进细胞向豁膜下层区域的迁移，更有利于组织修复。

应用富集毛囊干细胞构建组织工程化尿道，具有重要的临床意义。毛囊来源丰富，获取比较容易，避免了切取皮肤或口腔薪膜组织对身体造成的创伤以及因此产生的感染风险，通过对一毛囊十细胞分选时多参数的不断调整，构建组织工程化尿道的条件可以不断被优化。干细胞的富集程度可影响缺损的修复效果，本研究中实验组修复后尿道癖痕组织形成的程度较轻，至于干细胞抑制癖痕组织形成的机制尚有待进一步研究。

参考文献

[1]傅强,邓辰亮,殷德明. 脱细胞基质载体和表皮细胞结合构建尿道的实验研究[J].中华泌尿外科杂志,2006,(z1):S128-S130.

[2]Li C,Xu Y,Song L. Preliminary experimental study of tissue-engineered urethral reconstruction using oral keratinocytes seeded on BAMG[J].Urologia International,2008,(03):290-295.

[3]Li C,Xu YM,Song LJ. Urethral reconstruction using oral keratinocyte seeded bladder acellular matrix grafts[J].The Journal of Urology,2008,(04):1538-1542.

[4]华云旗,李秀兰,张杨. 毛囊干细胞的分离及培养方法研究[J].国际生物医学工程杂志,2007,(03):133-137.

[5]杨青,李秀兰,张杨. 表皮干细胞与毛囊干细胞生物学特性的比较[J].中国组织工程研究,2012,(27):5034-5038.

[6]Jiang S,Zhao L,Purandare B. Differential expression of stem cell markers in human follicular bulge and interfollicular epidermal compartments[J].Histochemistry and Cell Biology,2010,(04):455-465.

[7]邓辰亮,王佳呜,崔磊. 多参数复合分选表皮干细胞的初步实验研究[J].组织工程与重建外科杂志,2006,(02):102-104.

[8]Ohyama M,Terunuma A,Tock CL. Characterization and isolation of stem cell-enriched human hair follicle bulge cells[J].Journal of Clinical Investigation,2006,(01):249-260.