XRCC3基因多态性与汉族人群膀胱癌的相关性

　　作者：郝钢跃,张月英,张维东,杨明山,贾青　　作者单位：首都医科大学附属北京友谊医院泌尿外科，北京 100037

　　【摘要】目的 探讨DNA修复基因XRCC3多态性与膀胱癌危险性的关系。方法 选择中国汉族人群中膀胱癌患者307例为病例组，316例非肿瘤泌尿系疾病患者为对照组，两组年龄性别构成均衡。以PCRRFLP技术，检测病例组和对照组的XRCC3(Thr241Met)基因型，比较不同基因型与膀胱癌危险性以及膀胱癌临床特征的关系。结果 XRCC3基因型Thr/Thr、Thr/Met和Met/Met在病例组的分布频率分别为87.3%、12.1%和0.6%，在对照组的分布频率为92.4%、7.3%和0.3%。与携带Thr/Thr的个体相比，携带XRCC3变异基因型(Thr/Met和Met/Met)的个体具有更高的患癌风险(OR, 1.77;95%CI, 1.04～3.02)。XRCC3基因型与吸烟没有交互作用，与膀胱癌的临床类型亦无相关性，但与浅表性膀胱癌的复发关系密切。携带XRCC3变异基因型的浅表性膀胱癌患者具有更高的复发风险(OR，3.08;95%CI，1.13～8.41)。结论 XRCC3基因多态性与膀胱癌危险性有关，携带变异基因型的个体易患膀胱癌，而且XRCC3基因有可能成为一个预测膀胱癌复发的指标。

　　【关键词】 多态性，限制性片段长度;膀胱肿瘤;复发;X线交错互补修复基因3

　　ARelationship between XRCC3 gene polymorphism and

　　bladder cancer in the Han population

　　HAO Gangyue1， ZHANG Yueying2, ZHANG Weidong2, YANG Mingshan3, JIA Qing2

　　(1. Department of Urology, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University, Beijing 100037, China;

　　2. Institute of Basic Medicine, Shandong Academy of Medical Science, Key Laboratory for

　　Modern Medicine and Technology of Shandong Province, Jinan 250062, China;

　　3. Department of Urology, Shandong Tumor Prevention and Treatment Hospital, Jinan 250117, China)

　　To investigate the relationship between polymorphisms of DNA repair gene XRCC3 and the risk and clinical outcome of bladder cancer. Methods In a hospital based casecontrol study for the Chinese population, a total of 307 bladder cancer cases and 316 age and sexmatched controls with urological nonneoplastic diseases were collected. We analyzed the genotypes of XRCC3 (Thr241Met) by PCRRFLP and determined their association with bladder cancer risk and clinical outcome. Results The frequency of Thr/Thr, Thr/Met and Met/Met genotype was 87.3%, 12.1% and 0. 6% in cases and was 92.4%, 7.3% and 0.3% in controls. When Thr/Thr served as the reference group, variant genotypes (Thr/Met and Met/Met) had a significant increased risk of bladder cancer(OR, 1.77;95%CI, 1.043.02). Combined with smoking and clinical types, no significant interaction could be found. However, the variant genotypes were associated with an increase of recurrence risk among superficial bladder cancer(OR，3.08;95%CI，1.138.41). Conclusions XRCC3 gene polymorphism may be a risk factor for bladder cancer and it may serve as a molecular marker for monitoring bladder cancer recurrence.

　　Key words: Polymorphism, restriction fragment length; Bladder neoplasms; Recurrence; Xray repair crosscomplementing gene 3

　　膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤， 越来越多的证据表明， 环境因素与遗传因素相互作用是膀胱癌发生的重要原因。 除了致癌物代谢酶的遗传背景差异外[12]， DNA修复基因参与致癌物所致DNA损伤的修复， 其多态性也可以影响膀胱癌的易感性。 X线交错互补修复基因3(Xray repair crosscomplementing gene 3, XRCC3)定位于人类染色体14q32.3, 是Rad51 DNA修复基因家族成员，其编码的XRCC3蛋白是重要的双链修复因子，在维持染色体稳定和参与DNA损伤的同源重组修复通路中具有重要作用。目前， XRCC3基因多态性与膀胱癌危险性以及膀胱癌临床特征之间的关系尚不清楚。本研究对XRCC3(Thr241Met)基因多态性在中国汉族人群的分布特征进行检测和分析， 旨在探讨其对膀胱癌发生发展的影响，为膀胱癌的防治提供理论依据。

　　1 资料与方法

　　1.1 研究对象 2000年2月至2006年2月于山东大学第二医院、山东省肿瘤医院和北京友谊医院住院治疗的膀胱癌患者307例为病例组。男251例，女56例，平均年龄61.3岁，吸烟者194例，不吸烟者113例。上述病例均为初诊膀胱癌患者，不包括膀胱癌复发患者，未经化疗、放疗，并且无任何其他肿瘤病史。肿瘤组织经病理诊断均为膀胱移行细胞癌，其中浅表性224例，浸润性83例。术后定期随访，以浅表性膀胱癌患者肿瘤复发作为研究终点。来自同期住院的非肿瘤泌尿系疾病患者316例为对照组。病例组和对照组所选研究对象均为中国汉族人，在年龄和性别构成上均衡，结果具有可比性。采用统一的调查表对病例组和对照组个体进行问卷调查，调查内容包括一般情况、个人健康史、职业史和生活习惯等。

　　1.2 研究方法

　　1.2.1 基因组DNA提取 调查对象均抽取静脉血10?mL，ACD(单结晶水枸橼酸、枸橼酸三钠、D葡萄糖)抗凝。用美国Puregene公司产DNA提取试剂盒提取基因组DNA。用Low Mass DNA Ladder进行DNA定量，稀释至20?ng/μL备用。

　　1.2.2 基因型检测 采用PCRRFLP技术检测XRCC3(Thr241Met)基因型，具体操作方法见参考文献[3]。引物序列，Sense:5′GCCTGGTGGTCATCGACTC3′;Antisense:5′ACAGGGCTCTGGAA GGCACTGCT CAGCTCACGCACC3′ 。PCR反应体系均为20?μL，其中含有基因组DNA 10?ng;Taq DNA聚合酶0.4?U;PCR缓冲液(1.5?mmol MgCl2; 50?mmol dNTPs;250?nmol 引物)。PCR反应条件：94?℃，5?min，32个循环(94?℃ 45?s，60?℃ 45?s，72?℃ 1?min)，延伸72?℃ 5?min，PCR扩增产物为136?bp。

　　1.2.3 酶切分析 扩增产物经限制性内切酶NcoⅠ酶切，Thr等位基因无NcoⅠ酶切位点;Met等位基因酶切后产生39?bp和97?bp两个片段。酶切后用含2%琼脂糖电泳进行电泳。Thr241Met存在3个基因型：野生型纯合子Thr/Thr(136?bp),杂合子Thr/Met(39?bp+97?bp+136?bp), 突变型纯合子Met(39?bp+97?bp)，电泳图谱见图1。

　　PCRRFLP技术检测XRCC3(Thr241Met)基因型

　　M：Marker;1：杂合子Thr/Met;2：突变型纯合子Met/Met;3：野生型纯合子Thr/Thr

　　Fig.1 PCRbased restriction fragment length polymorphism genotyping for XRCC3(Thr241Met)

　　M: Marker; Lane 1:Thr/Met heterozygotes; Lane 2: Met/Met homozygotes; Lane 3:Thr/Thr homozygotes1.3 统计学处理 分别计算病例组和对照组中XRCC3(Thr241Met)等位基因频率， 以比值比OR及95%可信区间表示各种基因型与膀胱癌风险的相关性。OR值以非条件logistic回归计算，并经年龄、 性别和吸烟状况校正， P<0.05为差异有统计学意义。采用SPSS for Windows 13.0软件行统计学分析。

　　2 结 果

　　2.1 XRCC3(Thr241Met)基因型的分布频率 XRCC3(Thr241Met)基因型Thr/Thr、Thr/Met和Met/Met在病例组的分布频率为87.3%、12.1%和0.6%，在对照组的分布频率为92.4%、7.3%和0.3%。XRCC3 241Met等位基因在病例组和对照组中的分布频率分别为6.7%和4.0%。基因型在病例组和对照组中的分布频率符合HardyWeinberg平衡(P>0.05)。由于Met/Met基因型在研究对象中的分布频率极低，因此，将Met/Met与Thr/Met合并，统称为变异基因型。

　　2.2 XRCC3(Thr241Met)基因型与膀胱癌危险性的关系 与携带Thr/Thr的个体相比，携带XRCC3变异基因型的个体具有更高的患癌风险(OR, 1.77,95%CI, 1.04～3.02)(P<0.05)。吸烟组(OR, 1.72, 95%CI, 0.81～3.61)和非吸烟组(OR, 1.90, 95%CI, 0.88～4.12)，XRCC3基因型在病例组和对照组中的分布差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。表1 XRCC3基因型与膀胱癌风险的关系表2 XRCC3基因型与膀胱癌分期的关系

　　浅表性浸润性OR(95%CI)194(86.6)74(89.2)1.00(reference)Thr/Met1.38(0.61～3.16)Met/Met0.38(0.02～6.18)Thr/Met, Met/Met1.27(0.58～2.80)2.4 XRCC3(Thr241Met)基因型与浅表性膀胱癌复发的关系 平均随访时间33个月(6～62个月)。224例浅表性膀胱癌患者共有145例复发。XRCC3变异基因型在复发与未复发组的分布频率分别为17.2%和6.3%, 两组比差异有统计学意义(P<0.05)。携带XRCC3变异基因型的浅表性膀胱癌患者具有更高的复发风险(OR，3.08，95%CI，1.13～8.41)，见表3。表3 XRCC3基因型与膀胱癌复发的关系

　　3 讨 论

　　XRCC3(Thr241Met)变异基因型在不同种族间的分布频率具有明显的差异。而且，人种的同源性特征非常明显。因为，欧洲和北美白种人的相关研究结果基本一致，而关于亚洲人群的研究结果也基本一致。在两项基于中国汉族人群的调查中，Shen等[3]报道江苏人群XRCC3 241Met分布频率为4.8%，并且未发现Met/Met纯合子;Yeh等[4]报道台湾人群XRCC3 241Met分布频率为5.3%。本研究显示，XRCC3 241Met等位基因在对照组的分布频率为4.0%，Met/Met纯合子为0.3%，检测结果与上述两项研究结果相近。结合其他关于亚洲人种的研究结果：韩国人4.7%[6]，泰国人7.6%[5]， 可以发现XRCC3(Thr241Met)变异基因型在东亚人群的分布频率明显低于白种人群。

　　本研究对XRCC3(Thr241Met)与膀胱癌风险性的关系进行了分析。结果显示XRCC3(Thr241Met)变异基因型在病例组和对照组的分布频率分别为12.7%和7.6%。以野生型Thr/Thr为参照，携带XRCC3变异基因型(Thr/Met和Met/Met)的个体患膀胱癌的风险增加1.77倍(OR, 1.77,95%CI, 1.04～3.02)，可见XRCC3基因多态性与膀胱癌发生具有显著的相关性。XRCC3基因第241个密码子的多态性，导致蛋氨酸(Met)替代苏氨酸(Thr)，氨基酸替代可能影响XRCC3修复酶的功能并且影响它与其他蛋白的相互作用，从而使XRCC3缺失细胞呈现遗传不稳定性和增加对DNA损伤因子的易感性。Matullo等[7]报道，XRCC3 241Met等位基因与外周血淋巴细胞中的高水平DNA加合物显著相关，而且膀胱癌易感性与环境致癌物暴露水平有关。然而，我们并未发现与吸烟状况相关的XRCC3 241Met分布频率的统计学差异，表明XRCC3(Thr241Met)基因多态性与吸烟无交互作用。

　　XRCC3基因多态性与肿瘤易感性的研究结果很不一致，甚至是相互矛盾、不可重复的[8]。Han等[9]综合分析了48项病例对照研究结果，发现XRCC3(Thr241Met)基因多态性是乳腺癌、头颈部肿瘤和膀胱癌的危险因素，但与肺癌、白血病、结肠癌、胃癌无关。相反，它可以降低非黑色素瘤皮肤癌发生的风险。事实上，同一基因在不同人群、不同肿瘤中发挥不同的作用，因为，肿瘤发生是一非常复杂的过程，涉及到多种因素参与。研究结果存在差异可能与不同类型的肿瘤具有不同的遗传异质性，研究对象的人种差异、地区差异，研究设计方法的不同以及样本量的大小等有关。

　　膀胱肿瘤按照病程进展分为浸润性膀胱癌和浅表性膀胱癌，浸润性膀胱癌病程进展迅速，患者预后差;而浅表性膀胱癌的显著特点是频繁复发，高达70%的患者将在短期内多次出现肿瘤复发，其中30%将进展为更高分期和分级的肿瘤。疾病进程的差异可能与膀胱癌发生发展的分子机制有关，而诸多研究也试图从分子遗传学角度阐述个体差异，寻找判断膀胱癌预后的标志物。本研究对膀胱癌病例进行分层分析，结果显示XRCC3(Thr241Met)变异基因型在浅表性和浸润性膀胱癌中的分布没有显著性差异，但是XRCC3基因多态性与浅表性膀胱癌的关系密切。携带XRCC3(Thr241Met)变异基因型的浅表性膀胱癌患者具有更高的复发危险。由于XRCC3表型的功能尚不清楚，对这一发现还不能做出明确解释，但可能的原因是XRCC3(Thr241Met)变异基因造成DNA修复能力减低，染色体不稳定性增加，为基因突变和癌基因激活引起细胞癌变提供了条件，致使肿瘤容易复发。相关的研究也显示高危浅表性肿瘤常伴有9号染色体缺失、p53突变以及17号染色体杂合缺失等[10]。然而，文献报道，有效的DNA修复能力并不总是防止肿瘤复发因素。Catto等[11]发现两个错配修复基因(hMLH1和hMLH2)缺失表达，可以减低浅表性膀胱癌的复发率。另外，Bosken等[12]报道，有效的DNA修复能力与接受化疗的非小细胞肺癌的低生存率有关。本研究并不排除结果偏差的可能性，因为，分层分析的样本量相对较少，但是，这至少提示了有关DNA修复基因多态性的研究是阐明膀胱癌复发机制的一个方向。

　　总之，本研究显示XRCC3基因多态性与膀胱癌的危险性密切相关，携带XRCC3(Thr241Met)变异基因型的个体具有更高的患癌风险。而且，XRCC3基因有可能成为一个判断浅表性膀胱癌复发的有益指标，这对于膀胱癌的防治具有重要价值。将来，应克服单一基因研究的缺陷，因为，基于同一作用通道的多基因研究能够证实和扩展我们现有的结论。其次，相关基因的功能研究以及评估表型与基因型的关系是必须的。另外，在扩大样本量的基础上，应对膀胱癌进行更详尽的分层，进一步探讨基因型与膀胱癌临床特征的关系，基因型与药物治疗反应的关系。

　　【参考文献】

　　[1] 〖ZK(#]郝钢跃,张维东,张道新,等.NAT2基因多态性与膀胱肿瘤的关系[J].中华肿瘤杂志, 2004, 26(5):283286.

　　[2] 郝钢跃,许纯孝,杨明山,等.GSTM1基因多态性和膀胱癌遗传易感性的关系[J].中华泌尿外科杂志, 2002, 23(6):344346.

　　[3] Shen H, Wang X, Hu Z, et al. Polymorphisms of DNA repair gene XRCC3 Thr241Met and risk of gastric cancer in a chinese population[J]. Cancer Lett,2004, 206(1):5158.

　　[4] Yeh C C, Sung F C, Tang R, et al. Polymorphisms of the XRCC1, XRCC3, & XPD genes, and colorectal cancer risk: a casecontrol study in Taiwan[J]. BMC Cancer, 2005, 5(1):1219.

　　[5] Kietthubthew S, Sriplung H, Au W W, et al. Polymorphism in DNA repair genes and oral squamous cell carcinoma in Thailand[J]. Int J Hyg Environ Health, 2006, 209(1):2129.

　　[6] Lee S A, Lee K M, Park S K, et al. Genetic polymorphism of XRCC3 Thr(241)Met and breast cancer risk: casecontrol study in Korean women and metaanalysis of 12 studies[J]. Breast Cancer Res Treat,2007, 103(1): 7176.

　　[7] Matullo G, Guarrera S, Carturan S, et al. DNA repair gene polymorphisms, bulky DNA adducts in white blood cells and bladder cancer in a casecontrol study[J]. Int J Cancer, 2001, 92(4): 562567.

　　[8] Shen M, Hung R J, Brennan P, et al. Polymorphisms of the DNA repair genes XRCC1, XRCC3, XPD, interaction with environmental exposures, and bladder cancer risk in a casecontrol study in northern Italy[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2003, 12(11 Pt 1): 12341240.

　　[9] Han S, Zhang H T, Wang Z, et al. DNA repair gene XRCC3 polymorphisms and cancer risk: a metaanalysis of 48 casecontrol studies[J]. Eur J Hum Gene, 2006, 14(10): 11361144.

　　[10] Knowles M A. Molecular subtypes of bladder cancer: Jekyll and Hyde or chalk and cheese [J]. Carcinogenesis, 2006, 27(3): 361373.

　　[11] Catto J W, Xinarianos G, Burton J L, et al. Differential expression of hMLH1 and hMSH2 is related to bladder cancer grade, stage and prognosis but not microsatellite instability[J]. Int J Cancer, 2003, 105(4): 484490.

　　[12] Bosken C H, Wei Q, Amos C I, et al. An analysis of DNA repair as a determinant of survival in patients with nonsmallcell lung cancer[J]. J Natl Cancer Inst, 2002, 94(14): 10911099.