SHSY5Y神经细胞中尼古丁受体α3亚单位基因表达抑制与APP代谢的关系

　　　作者：唐智 安宇 齐晓岚 肖雁 单可人 官志忠 作者单位：贵阳中医学院第一附属医院检验科，贵州 贵阳 55000

　　【摘要】 目的 用RNA干扰技术抑制神经型尼古丁受体(nAChR) α3亚单位基因表达并观察对神经细胞淀粉样蛋白前体蛋白(APP)代谢的影响。方法 设计并体外合成α3 nAChR的特异性编码siRNA序列的寡核苷酸，退火后克隆至pSliencer 3.1H1 neo质粒中，构建重组质粒α3 nAChR pSilencer 3.1H1 neo。将α3 nAChR pSilencer 3.1H1 neo转染SHSY5Y细胞，用含G418的培养液筛选，挑选阳性克隆后采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹方法检测转染细胞中α3 nAChR mRNA 及蛋白表达水平的变化;并测定分泌型 APP、总 APP 蛋白表达的变化。结果 成功构建α3 nAChR siRNA表达质粒，转染后经G418筛选获得稳定转染重组质粒的细胞克隆株，与对照组相比，α3 nAChR mRNA 及蛋白表达量均降低(抑制率分别为98%和66%);分泌型APP表达下降，总APP水平比较表达水平无显著性差异。结论 α3 nAChR siRNA表达质粒能特异性抑制α3 nAChR 基因表达，α3 nAChR可能通过增加α分泌酶对APP的切割发挥神经保护作用。

　　【关键词】 siRNA;α3神经型尼古丁受体;神经母细胞瘤细胞;淀粉样蛋白前体蛋白

　　Correlation between inhibited gene expression of nicotinic acetylcholine receptor α3 subunit in SHSY5Y cells and APP metabolism

　　TANG Zhi, AN Yu, QI XiaoLan, et al.

　　Department of Clinical Laboratory，the First Affiliated Hospital of Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550004, Guizhou, China

　　【Abstract】 Objective To investigate the influence of inhibited gene expression of α3 nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) induced by RNA interference on the metabolism of (amyloid precursor peptide (APP). Methods The siRNA coding oligonucleotide sequences targeting α3 nAChR were designed and synthesized. The annealed product was cloned into pSliencer 3.1H1 neo vector. The recombinant α3 nAChR pSilencer 3.1H1 neo vector was transfected into the SHSY5Y cells. The stable clones were screened by G418 medium, and the levels of α3 nAChR mRNA and protein were monitored by using Realtime PCR and Western blotting respectively. The levels of the (form of secreted APP ((APPs) and total APP were also determined by Western blotting. Results Compared with control, the expression levels of mRNA and protein in the SHSY5Y cells transfected with the recombinant α3 nAChR pSilencer 3.1H1 neo vector were decreased by the inhibitory efficiency with 98% and 66% respectively. The protein level of the αAPPs was reduced and no significant change of total APP was observed. Conclusions The inhibited gene expression of α3 nAChR resulted from the recombinant α3 nAChR siRNA can decrease cleavage of APP by (secretase, which suggest that α3 nAChR may play a significant neuroprotective role in the pathogenesis of Alzheimer′s disease.

　　【Key words】 Silence interference RNA; α3 nAChR; Neuroblastoma cell; Amyloid precursor peptide

　　神经型尼古丁受体(nAChR)与大脑学习记忆、智力发育和识别能力等脑功能有关，还具有明显的神经保护作用〔1～3〕。研究表明，尼古丁受体与淀粉样前体蛋白(APP) 的代谢过程有密切联系，在阿尔茨海默病(AD)的发病中起着重要的作用〔2〕。小干扰RNA(siRNA)能特异性结合并切割同源性mRNA，是转录后基因沉默现象的重要机制之一〔4〕。运用siRNA真核表达载体在哺乳动物细胞内合成siRNA能高效抑制特异性的基因表达〔5，6〕。本研究构建了神经母细胞瘤(SHSY5Y)细胞α3 nAChR特异性siRNA真核表达载体，抑制SHSY5Y 细胞α3 nAChR 的表达，来研究APP 代谢过程的变化，并深入研究α3 nAChR在AD发病中的保护作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 试剂及设备

　　DMEM培养液购自Gibco Introvagen 公司(英国);普通化学试剂均购自 Sigma 公司;源于人脑的神经母细胞瘤细胞株 (SHSY5Y细胞)购于 German Collection of Microorganisms and Cell Cultures公司(德国);羊抗3、鼠抗β肌动蛋白(βactin )多克隆抗体及辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的抗羊及抗鼠二抗购自Santa Cruz公司(国);Lipofectamine 2000购于Invitrogen公司(美国);pSilencerTM 3.1H1 neo质粒和阴性对照siRNA购自Ambion 公(国);E.Z.N.AENDOfree plasmid Mini Kit购于Omega公司。

　　1.2 siRNA的设计、合成

　　根据GenEbank提供的α3 nAChR(NM_000743.2)、siRNA设计原则和BLAST同源分析，利用Ambion公司提供的在线软件(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)设计针对α3 nAChR基因编码区(460～480 bp)的寡核苷酸模板序列：正义链 5′GATCC G TGA CTA CAA GCT GAA GTG GTT CAA GAG ACC ACT TCA GCT TGT AGT CAT TTT TTG GAA A3′;反义链 5′AGC TTT TCC AAA AAA TGA CTA CAA GCT GAA GTG GTC TCT TGA ACC ACT TCA GCT TGT AGT CA C G3′;(由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)。此互补序列为两条反向重复序列，两端分别带有HindⅢ和BamHⅠ的酶切位点，中间为9个连续碱基TTCAAGAG A分隔的反相重复靶序列，并以6个T做为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。

　　1.3 表达质粒的构建、转化及鉴定

　　根据Ambion公司pSilencerTM neo试剂说明操作。将模板链退火连接，用T4DNA连接酶将其定向克隆至线性化质粒pSilencerTM 3.1H1 neo H1启动子之后，构建成重组体质粒。将重组体质粒转化DH5α大肠杆菌,挑选单克隆菌落培养扩增。用质粒提取试剂盒抽提细菌质粒DNA，质粒DNA酶切、电泳鉴定插入片段大小，测序鉴定插入碱基序列和方向。

　　1.4 细胞培养和转染

　　SHSY5Y细胞常规培养，培养基为 DMEM，加入15%胎牛血清，100 U/ml青霉素，100 U/ml链霉素，于37℃、5% CO2培养箱培养。生长良好的细胞于转染前1 d传代于6孔板，细胞融合率达80%～90%时采用脂质体Lipofectamine 2000进行转染，按转染试剂盒说明书进行操作。设空白对照组、阴性对照siRNA组和α3 nAChRsiRNA组，转染24 h后1×103个细胞/ml传代，0.8 mg/ml G418培养液筛选14 d，挑取阳性克隆并进行扩增培养。收集阳性克隆细胞测定α3nAChR mRNA及蛋白质水平。

　　1.5 Realtime PCR检测α3 nAChR mRNA 表达

　　采用 Trizol一步法提取细胞总RNA。将mRNA逆转录反应成cDNA。以逆转录产物为模板进行Realtime PCR。PCR条件：50℃ 2 min，95℃ 10 min，然后以95℃ 15 s、60℃ 1 min进行40个循环。分析实验结果以βactin为内对照，计算α3 nAChR的相对水平。

　　1.6 蛋白表达水平测定

　　参照Guan 等〔7〕 的方法提取细胞蛋白并定量测定分泌型APP，收集培养基，13 000 r/min离心15 min后取上清，进行检测。用蛋白质印迹方法检测α3 nAChR亚单位、分泌型APP、总 APP蛋白表达水平。

　　1.7 统计学分析

　　数据以x±s表示，用SPSS14.0进行两因素析因设计资料的方差分析和成组设计资料的t检验。

　　2 结 果

　　2.1 siRNA表达质粒的鉴定

　　将α3 nAChR pSilencer 3.1H1 neo重组质粒用BamH I和HindⅢ双酶切，琼脂糖凝胶电泳结果出现64和4 285 bp条带，与实验设计的模板长度相符。将重组质粒进行DNA序列测序结果与模板序列相符，进一步表明α3 nAChR基因的siRNA表达质粒构建成功。见图1。

　　2.2 转染α3 nAChR pSilencer 3.1H1 neo质粒后mRNA 及蛋白表达水平

　　转染后SHSY5Y细胞内α3 nAChR mRNA水平(36.846±0.15)较对照组(34.334±0.31)下降98%(P<0.01)，而转染阴性对照组mRNA水平(34.64±0.22)与对照组无显著差异(P>0.05)。转染后SHSY5Y细胞α3 nAChR蛋白表达水平(33.7%±8.8%)较对照组(100.0%±5.0%)下降66% (P<0.01)，而转染阴性对照组蛋白质水平(99.2%±5.5%)与对照组无显著差异(P>0.05)。

　　2.3 转染处理细胞 APP 表达水平的变化

　　转染后SHSY5Y 细胞内分泌型APP表达水平(71.7%±2.1%)较对照组(100.0%±7.1%)下降明显(P<0.05)。转染后SHSY5Y细胞内总APP水平(100.0%±11.4%)与对照组(100.2%±17.3%)无显著差异 (图2)。

　　3 讨 论

　　在SHSY5Y神经细胞中，α3和α7是主要的尼古丁受体亚类，与AD的发病有关。研究发现，用RNAi技术抑制α7 mRNA表达后，可使分泌型APP水平下降、脂质过氧化产物含量增加、并增强Aβ的神经细胞毒性作用〔8〕。但是，对α3 nAChR的功能尚不清楚。因此，本研究构建了α3 nAChR siRNA真核表达载体，并转染至SHSY5Y细胞，结果表明siRNA能有效地抑制内源性α3 nAChR 基因的表达。

　　已经证明在AD脑组织中老年斑的主要成分Aβ是由其前体蛋白APP经分泌酶β和γ水解后形成的，具有一定的神经毒性作用。另一种α分泌酶，剪切于APP蛋白中部，将 Aβ 切成两段，产生分泌型 APP，从而减少Aβ 的产生〔9〕。本研究发现转染 α3 nAChR 基因 siRNA 片段的 SHSY5Y 细胞分泌型APP表达减少，说明抑制 α3 nAChR 基因的表达减少分泌型APP 的分泌，而总 APP 表达水平无变化，从而增加 Aβ 的产生，显示α3 nAChR可能通过增加α分泌酶活性来发挥神经保护作用。而分泌酶将 APP 蛋白在A 区的第16和17个氨基酸之间切开，产生一段可溶性的N端APP片段即分泌型 APP，从而减少Aβ的产生〔10〕。本研究说明抑制α3 nAChR基因的表达可减少APPs 的分泌，而总 APP 表达水平无变化，间接表明APPs 产生，增加Aβ的蓄积，提示α3 nAChR可能通过增加α分泌酶活性来发挥神经保护作用。

　　【参考文献】

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　　7 Guan ZZ，Miao H，Tian JY，et al.Suppressed expression of nicotinic acetylcholine receptors by nanomolar betaamyloid peptides in PC12 cells〔J〕.J Neural Transm，2001;108(12):141733.

　　8 Qi XL，Nordberg A，Xiu J，et al.The consequences of reducing expression of the α7 nicotinic receptor by RNA interference and of stimulating its activity with an α7 agonist in SHSY5Y cells indicate that this receptor plays a neuroprotective role in connection with the pathogenesis of Alzheimer′s disease〔J〕.Neurochem Int，2007;51(67):37783.

　　9 Cole SL，Vassar R.BACE1 structure and function in health and Alzheimer′s disease〔J〕.Curr Alzheimer Res，2008;5(2):10020.

　　10 Fahrenholz F.Alphasecretase as a therapeutic target〔J〕.Curr Alzheimer Res，2007;4(4):4127.