腺病毒介导胞嘧啶脱氨酶基因联合αIFN治疗肾癌的实验观察

　　作者：赵国志,郑少斌,谭万龙,姜耀东,刘阳　　作者单位：南方医科大学南方医院泌尿外科，广东 广州 510515

　　【摘要】 目的: 探讨腺病毒介导的胞嘧啶脱氨酶(CD)自杀基因联合αIFN对肾癌的治疗作用. 方法: 含CD基因重组腺病毒感染人肾癌细胞株7860，用噻唑蓝(MTT)方法观察加用5氟胞嘧啶(5Fc)或联用αIFN后的杀伤效应.建立7860裸鼠皮下移植瘤模型，瘤内注射腺病毒，腹腔注射5Fc(500 mg/kg)，联合应用αIFN时行瘤内注射，观察肿瘤生长情况. 结果: 在对感染腺病毒的7860细胞的体外杀伤实验中，CD+5Fc组的细胞存活率为(67.40±1.27)%，αIFN组的细胞存活率为(68.65±1.45)%，CD+5Fc+αIFN组细胞存活率为(34.67±2.38)%,(P=0.000)，两者之间有协同效应. 在7860裸鼠移植瘤模型中，CD+5Fc联合αIFN能够显著抑制肿瘤的生长. 结论: 腺病毒为载体的自杀基因CD加前体药5Fc联合αIFN可以明显增强抗肾癌效果.

　　【关键词】 腺病毒科;遗传载体;基因疗法;胞嘧啶脱氨酶;基因;干扰素α;腺癌，透明细胞;肾肿瘤

　　基金项目：广东省医学科研基金(A20004395)

　　Efficacy of adenovirusmediated CD gene combined with prodrugs and αIFN for treatment of human renal clear carcinoma

　　ZHAO GuoZhi, ZHENG ShaoBin, TAN WanLong, JIANG YaoDong, LIU Yang

　　Department of Urology, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China

　　【Abstract】 AIM: To study the cytotoxic efficacy of recombined treatment of human renal clear carcinoma with adenovirus mediated cytosinediaminase (CD) gene and 2IFN. METHODS: Adenovirus containing suicide gene CD was used to infect human renal clear carcinoma cells 7860, and in vitro cytotoxicity of infected 7860 cells treated by 5Fc or/and αIFN were evaluated with MTT method. The tumor growth suppression test was performed with nude mice model bearing 7860 subcutaneously injected intratumorally with AdCD combined with 5Fc (400 mg/kg) and αIFN (105 u/L). RESULTS: The rate of cell survival was only (34.67±2.38)% in the CD+5Fc+αIFN group, but (67.40±1.27)% in the CD+5Fc group and (68.65±1.45)% in the αIFN group(P=0.000). 5Fc and αIFN had obvious synergic effects. AdCD combined with 5Fc and αIFN significantly suppressed the growth of tumor in nude mice model. CONCLUSION: Recombinant adenovirus combined with prodrug and αIFN has a significant efficacy in treatment of human renal clear carcinoma.

　　【Keywords】 adenoviridae; genetic vectors; gene therapy; cytosine deaminase; genes; interferonalpha; adenocarcinoma, clear cell; kidney neoplasms

　　0 引言

　　肾癌的国外发病率呈上升趋势，每年死于肾癌者近万例[1] ，在我国也有逐年增加趋势. 早期无转移性肾癌，根治性手术是首选方案，但术后仍有复发和转移的可能，大约40%～70%的患者术后会出现肿瘤远处转移[2]. 晚期肾癌对放疗及化疗均不敏感,自杀基因及细胞因子治疗作为晚期肾癌的一种治疗方法，在肾癌的综合治疗中发挥了重要作用. 大肠杆菌胞嘧啶脱胺酶(E.coli.cytosine deaminase,CD)基因/5氟胞嘧啶(5Fc)治疗系统是单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virusthymidine kinase,HSVTK)基因/无环鸟苷(GCV)系统后受广泛关注的新的自杀基因，同时细胞因子在实体肿瘤治疗中也进行了广泛的研究. 本研究旨在探讨CD/5Fc系统及细胞因子在肾癌治疗中的价值.

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 人肾透明细胞癌株7860来源于中山大学生物教研室;HEK293细胞(南方医科大学泌尿外科保存);含有含有大肠杆菌胞嘧啶脱胺酶(E.coli cytosine deaminase,CD)基因和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)基因的复制缺陷腺病毒(AdCMVCD，or Adv)(美国洛杉矶儿童医院惠赠，南方医科大学南方医院泌尿外科保存);5周龄、雌性BALB/C裸鼠购自广州中医药大学实验动物中心(许可证SCxK<粤>20030001). 噻唑蓝(MTT),5Fc,αIFN购于Sigma公司;逆转录聚合酶链反应(RTPCR) kit购于大连宝生物公司; DMEM、胎牛血清为Gibco公司产品;绵羊AntiCD多克隆抗体购于Santo Cruz公司，HRP兔抗绵羊二抗及ECL发光试剂盒购于北京中山生物技术有限公司. CD基因和腺病毒E1基因的引物合成由上海英骏生物技术有限公司合成.

　　1.2 方法

　　1.2.1 重组腺病毒扩增及滴度的测定 用293细胞扩增腺病毒. 将7860按2×104接种于96孔板，每孔100 μL，第2 d加入待检病毒悬液60 μL，预稀释10倍，按2倍倍比稀释，继续培养，48 h后观察细胞病变情况，并计算病毒滴度.

　　1.2.2 腺病毒载体CD基因PCR鉴定 根据Genebank S56903CD基因DNA序列，由上海英骏生物技术有限公司分别设计并合成CD基因、腺病毒E1区基因上下游引物.

　　1.2.3 RTPCR检测腺病毒感染的的7860细胞CD基因mRNA表达 经腺病毒感染的7860细胞培养2 d后，TRIzol提取总RNA，逆转录反应按公司的逆转录试剂盒说明书操作，42℃反应60 min. PCR反应采用100 μL体系：模板cDNA 20 μL,10倍缓冲液10 μL,25 mmol/L MgCl2 10 μL，上、下引物(10 pmol/L) 2 μL, LATaq酶1 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL. 反应条件为: 94℃ 1 min，52℃ 1 min，72℃ 2 min，30个循环. 扩增产物在10 g/L琼脂糖凝胶中电泳鉴定.

　　1.2.4 MTT法测定细胞存活率 以每孔2×104 7860细胞接种96孔板，实验分组：1： 空白对照;2：αIFN组;3：Adv+5Fc组;4：Adv+5Fc +αIFN组，每组设3个复孔，于37℃，50 mL/L CO2条件下培养. 以未行任何处理的7860为空白对照组.12 h后换液，2,4组加αIFN(105 U/L);3,4组加入20 μL腺病毒感染1 h，然后加入完全培养液180 μL，24 h后加入前体药物5Fc(400 mg/L);继续培养4 d后，每孔加入MTT溶液(5 g/L) 20 μL，孵箱中继续培养4 h，弃去培养液，每孔加入DMSO 150 μL，室温避光振荡10 min，酶联免疫检测仪在570 nm处测各孔A值. 计算方法为：细胞存活率(%)=A实验组/A空白对照组×100%.

　　1.2.5 CD联合5Fc及αIFN对7860移植瘤模型的治疗作用 将2×107 7860细胞接种于裸鼠皮下，待肿瘤体积生长至100 mm3，选取肿瘤大小均一成瘤鼠，随机分为4组，同体外分组. 1组仅用PBS;2，4组瘤内αIFN 100 μL多点注射，隔日1次，共10 d;3, 4组将腺病毒100 μL多点注射入瘤内，1次/d/只，连续3 d，4～14 d给予腹腔注射5Fc (400 mg/kg),其余注射PBS. 注射完毕后继续观察2 d，测量瘤体大小，按公式计算：肿瘤体积=A×B2 /2(A: 长径;B: 短径)，结束实验，取各组鼠肿瘤进行病理学检查.

　　统计学处理： 应用SPSS13.0统计软件对数据进行统计学处理，数据用x±s表示，采用完全随机设计方差分析(oneway ANOVA)，组间比较采用LSD法，以P<0.05为具有统计学意义.

　　2 结果

　　2.1 腺病毒扩增及滴度测定 293细胞加入腺病毒24 h后，在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白(GFP)表达的293细胞，72 h几乎都表达GFP(图1)，收集细胞，经过反复冻融、离心、过滤后收集腺病毒悬液，CPE法测得腺病毒滴度为2×108 PFU/L.

　　A: 自然光镜; B: 荧光显微镜.

　　图1 扩增腺病毒293细胞GFP表达 ×200(略)

　　2.2 腺病毒CD基因的PCR鉴定 腺病毒DNA PCR扩增产物电泳后可见大小为233 bp的CD特异性片断，未见E1扩增片断(图2). 说明腺病毒含有所需CD，而不存在病毒复制所需E1基因，该病毒是本研究所需的含CD基因复制缺陷性病毒.

　　M： DNAmark; 1: CD基因; 2: 腺病毒E1基因.

　　图2 复制缺陷性病毒PCR鉴定(略)

　　2.3 感染腺病毒7860细胞CD基因mRNA表达 从腺病毒感染的7860细胞中提取RNA作RTPCR，特异地扩增出大小为233 bp的CD基因片断，与腺病毒DNA扩增结果一致，而未转染腺病毒的7860细胞未扩增出相应片断(图3). 说明感染腺病毒7860细胞中有CD基因mRNA表达，未感染病毒的7860细胞中不含CD基因. 证实了自杀基因转入肿瘤细胞，并成功表达.

　　M： DNAmark; 1： 感染Adv的7860细胞CD基因; 2: Adv的CD; 3: 未感染Adv的7860细胞CD基因.

　　图3 RTPCR产物电泳图(略)

　　2.4 5Fc对转染CD基因的细胞及联合αIFN对肾癌细胞7860杀伤作用 重组腺病毒AdCD易于感染7860细胞株，当以100的滴度感染时，感染效率可达93%. 对腺病毒感染后的7860细胞，在培养基中加入5Fc或者联合αIFN进行体外杀伤实验. 结果显示，感染腺病毒7860细胞用前体药物5Fc、及联用αIFN 72 h后，细胞存活率分别为(67.40±1.27)%，(34.67±2.38)%，单用αIFN为(68.65±1.44)%，都低于对照组(98.25±0.53)%，经比较有显著统计学差异(P=0.000). 各组间比较，Adv+5Fc 和αIFN组无显著统计学差异(P=0.098)，其余各组有显著统计学差异(P=0.000). 以上说明CD基因在细胞内成功的将5Fc转化成细胞毒性物质，导致细胞死亡，联合使用αIFN后效果增强.

　　2.5 CD基因与前药5Fc及联合αIFN抑制7860裸鼠移植瘤生长 治疗组裸鼠移植瘤体积与对照组之间的差异有统计学意义(F=295.847, P=0.000)，联合治疗组实验结束时的肿瘤体积(32.5±5.7) mm3，较单用αIFN组(366.8±45.4) mm3，Adv+5Fc组(318.9±12.3) mm3明显减小，除αIFN组，Adv+5Fc组间差异无统计学意义(P=0.159)，其余各组差异均有统计学意义(P=0.000). 与体外杀伤试验相一致.

　　2.6 裸鼠肾癌的组织病理学改变 各组裸鼠未出现致死等毒副作用，光镜下对照组见细胞排列紧密，异型性明显，可见核分裂相，治疗组可见肿瘤呈现不同程度的坏死，用TUNEL法检测细胞凋亡程度，自杀基因组凋亡细胞增多，联合αIFN后肿瘤凋亡现象更加明显;电镜下观察可见凋亡小体的形成(图4).

　　A: 7860细胞TUNEL染色; B: CD+5Fc作用7860细胞TUNEL染色; C: CD+5Fc+αIFN作用7860细胞TUNEL染色; 细胞核着色棕黄，形态呈碎点状、不规则者为凋亡细胞 (HE×200); D: CD+5Fc+αIFN作用7860细胞后细胞凋亡小体形成.

　　图4 7860治疗前后比病理变化比较 TEM ×20 000(略)

　　3 讨论

　　自杀基因治疗作为肿瘤基因治疗的主要策略之一，已在肝癌、乳腺癌、膀胱癌、恶性胸膜间皮瘤等恶性肿瘤治疗研究中取得了令人满意的结果，显现出良好的临床应用前景[3-6]. 继HSVTK基因之后研究最多的是CD基因，近来人们发现单一自杀基因的治疗效果和临床适用范围受到了限制，而应用自杀基因联合细胞因子、细胞因子基因治疗，则表现出协同作用[7]. 我们采用自杀基因CD联合αIFN对肾癌进行了杀伤性研究.

　　实现自杀基因治疗肿瘤必需将自杀基因导入肿瘤细胞中并表达，本研究采用是复制缺陷性腺病毒做载体，用E1基因引物对所用的病毒DNA进行PCR反应，结果并没有出现大小相当的DNA片断，说明该腺病毒不含E1基因，是复制缺陷性腺病毒. 我们所用的腺病毒还携带有GFP基因，感染病毒24 h后通过荧光显微镜就可见绿色荧光，表明目的基因已表达，使观察具有简便、快速、灵敏等优点[8]. 同时行RTPCR检测，转染细胞中含有CD基因的相应片断，未转染没有表达，与荧光显微镜观察到的绿色荧光一致. CD/5Fc通过表达胞嘧啶脱胺酶将无毒性前药5氟胞嘧啶(5Fc)脱胺转变为有细胞毒性的代谢产物5氟尿嘧啶(5Fu)，干扰和抑制细胞DNA，RNA合成而杀死细胞. IL2，LAK等生物治疗技术发展很快,但文献报道的临床有效率与α干扰素相比并无明显提高[9-10]. 目前很多学者认为α干扰素是治疗转移性肾癌和预防术后复发的首选方法.国内石明等[11]通过对45例术后患者应用干扰素治疗，早期肾癌患者5 a生存率无显著性差异，而对晚期肾癌患者可延长生存期，提高长期生存率，5 a生存率明显高于对照组. 但目前在治疗剂量、频率及持续时间存在争议.

　　本实验将CD/5Fc自杀基因系统联合αIFN应用到肾癌的治疗中，发现在体外杀伤实验中，CD/ 5Fc及αIFN单独应用时，即能产生明显的杀伤作用，而联合αIFN后杀伤效果更为显著. 在体内杀伤实验中，CD/5Fc系统联合αIFN的肿瘤体积比各自单独使用的肿瘤体积缩小8倍，联合治疗有明显协同作用.

　　我们将自杀基因及细胞因子应用于肾癌的治疗中，显示CD基因联合αIFN治疗优于单组治疗，但是实验结果也显示进一步提高自杀基因的杀伤效率是必要的，因为在本实验中肿瘤的生长未完全抑制. 进一步的研究方向是，设计高效靶向的基因转运载体，实现安全可控的基因表达以及多基因联合应用等[12].

　　【参考文献】

　　[1] Kirkali Z, Tuzel E, Mungan MU. Recent advances in kidney cancer and metastatic disease[J]. BJU Int，2001,88(8):818-824.

　　[2] Papac RJ, Keohane MF. Hormonal therapy for metastatic renal cell carcinoma combined androgen and provera followed by high dose tamoxifen[J]. Eur J Cancer,1993,29A:997-999.

　　[3] Jiao LR, Havlik R, Nicholls J, et al. Suicide gene therapy in liver tumors[J]. Methods Mol Med, 2004,90:433-450.

　　[4] Brown NL, Lemoine NR. Clinical trials with GDEPT: Cytosine deaminase and 5fluorocytosine[J]. Methods Mol Med, 2004,90:451-457.

　　[5] Sterman DH, Recio A, Vachani A,et al. Longterm followup of patients with malignant pleural mesothelioma receiving highdose adenovirus herpes simplex thymidine kinase/ganciclovir suicide gene therapy[J]. Clin Cancer Res, 2005,11(20):7444-7453.

　　[6] 谭万龙，谢 毅，郑少斌，等. 腺病毒介导融合双自杀基因治疗膀胱癌[J]. 南方医科大学学报，2006，26(5)：594-597.

　　[7] Rogulski KR, Wing MS, Paielli DL, et al. Double suicide gene therapy augments the antitumor activity of a replicationcompetent lytic adenovirus through enhanced cytotoxicity and radiosensitization[J]. Hum Gene Ther, 2000,11(1):67-76.

　　[8] Hoffman R. Green fluorescent protein imaging of tumour growth, metastasis, and angiogenesis in mouse models[J]. Lancet Oncol, 2002,3(9):546-556.

　　[9] Horoszewics JS, Murphy GP. Anassessment of the current use of human intertferons in therapy of urological cancers[J]. J Urol,1989,142:173-181.

　　[10] Atzpodien J, Kirchner H. IL2 in combination with IFNalpha and 5FU versus tamoxifen in metastatic renal cell carcinoma longterm results of a controlled randomized clinical trial[J].Br J Cancer,2001,85:1130-1136.

　　[11] 石 明，韩 平，曹贵华,等. 肾癌术后应用α干扰素的疗效分析[J]. 华西医学，2006，21(2)：288-289.

　　[12] Goncalves MA, van der Velde I, KnaanShanzer S, et al. Stable transduction of large DNA by highcapacity adenoassociated virus/adenovirus hybrid vectors[J]. Virology, 2004,321(2):287-296.