microRNA-21对膀胱癌T24细胞增殖的影响及对VEGF和AP1蛋白的调节

　　作者：杨国胜1,刘百川1*,尹智峰2　　作者单位：1. 广东省第二人民医院泌尿外科， 广东 广州 510317; 2. 南华大学第二附属医院泌尿外科， 湖南 衡阳

　　【摘要】【目的】研究microRNA-21(miR-21)对膀胱癌T24细胞系中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)和活化因子蛋白-1(activator protein-1， AP1)及mRNA表达的调节作用，探讨miR-21对膀胱癌T24细胞增殖的影响。 【方法】 用人工合成的miR-21相应的双链互补DNA片段，插入pSilencerTM 3.1-H1 neo载体表达载体，经测序鉴定后作为microRNA的表达质粒;用脂质体将miR-21高表达质粒转染进T24膀胱癌细胞，经G418筛选获得阳性克隆。用RT-PCR技术和Western blot方法分别检测该细胞系中VEGF和AP1的mRNA和蛋白表达情况。四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测膀胱癌T24细胞增殖的变化情况。【结果】 Western blot结果显示miR-21能够增加VEGF和AP1蛋白的表达，RT-PCR方法分析显示VEGF和AP1 mRNA水平升高。MTT显示转染后细胞的生长速率比未转染的细胞明显加快。【结论】 miR-21促进T24膀胱癌细胞增殖， 提示可能与VEGF和AP1 的低表达有关。

　　【关键词】 microRNA-21; VEGF; AP1; T24细胞; 膀胱肿瘤

　　Abstract： 【Objective】 To investigate the role of miR-21 on the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and activator protein-1(AP1) protein and its mRNA， and to explore the effect of microRNA-21 in regulation of the proliferation of T24 bladder cancer cells. 【Methods】 Using the synthetic double-strand base pair (bp) DNA， which is based on the sequence of the miR-21， inserted the DNA of miR-21 into the vector of pSilencerTM 3.1-H1 neo， and cloned the microRNA highly expression plasmid. Then the miR-21 plasmid were transferred into T24 with Lipofectamine 2000， consequently cell line with the miR-21 highly expression was established by screening with G418. The level of VEGF and AP1 mRNA and protein were measured by using RT-PCR and Western blotting， respectively. Methylthiazolyltetrazolium (MTT) was used to analyze the proliferation of the T24. 【Results】 The Western blot results displayed that miR-21 promoted the expression of the VEGF and AP1 protein. RT-PCR also indicated that the mRNA of VEGF and AP1 increased. Compared with the control group， MTT method demonstrated that the growth rate of T24 treated with the miR-21 high expression was also significantly increased. 【Conclusion】 miR-21 can promote the proliferation of T24， suggesting that it was related to the low expression of VEGF and AP1.

　　膀胱肿瘤是泌尿系统中最常见的肿瘤，在国内膀胱肿瘤的发病率在男性泌尿生殖器肿瘤中占首位，其中男性发病率约为女性的3 ～ 4倍，年龄以50 ～ 70岁为多，严重危害人类的健康。microRNAs (miRNAs)是一类可调控基因表达的内源性非编码单链小分子RNA，长度约18 ～ 24 个核苷酸，通过与靶mRNA 特异的碱基配对，引起靶mRNA 降解或者翻译抑制，产生转录后基因沉默。miRNAs 的作用涉及多种生理和病理过程，已有大量实验证据表明，miRNAs在肿瘤[1-2]、心血管[3-4]、糖尿病[5]、胚胎发育[6-7]中异常表达。最新研究显示，microRNA与膀胱癌关系密切，Gottardo等[8]通过寡核苷酸芯片分析27例膀胱癌组织(25例癌组织和2例正常组织)，分析发现miR-223， miR-26b， miR-221， miR-103-1， miR-185， miR?鄄23b， miR-203， miR-17-5p， miR-23a和 miR-205表达显著上调。miR-21在癌症中十分活跃，有研究显示其在乳腺癌[9]、肝癌[10]等癌症中高表达，但是其在膀胱癌中作用鲜有报道。我们的实验就miR-21对膀胱癌VEGF和AP1蛋白及mRNA表达的调节作用及膀胱癌T24细胞增殖的影响做了初步探讨，报道如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 材 料

　　膀胱癌T24细胞系(上海拜力生物公司);质粒提取试剂盒(Invitrogen);总RNA提取试剂盒(Invitrogen);RT试剂盒(MBI);PCR试剂盒(Invitrogen);LipofectamineTM 2000转染试剂盒(Invitrogen);MTT试剂盒(Sigma);引物合成(Invitrogen);载体pSilencer-3.1 H1 neo (Ambion); E.coli DH5(Ambion)。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 细胞的培养和miR-21高表达质粒的构建

　　T24细胞培养于添加100 mL/L胎牛血清的1640培养液中，37 ℃，体积分数为5%的CO2孵箱中培养。根据miR-21的核苷酸序列5′-TAGCTTATCA GACTGATGTTGA-3′， 首先用DNA合成技术得到第一链DNA，接着用DNA连接反应合成双链DNA，之后插入pSilencerTM 3.1-H1 neo载体。将构建好的质粒转化进E.coli DH5α。转染后进行质粒扩增和提取。

　　1.2.2 脂质体介导的细胞转染

　　每孔20 × 104个细胞接种于六孔板中，24 h后，按0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L G418的量向相应孔中加入含有100 mL/L血清的培养基，每4 d换含抗生素的培养基，培养14 d后观察结果，然后根据观察结果，筛选出维持浓度。根据质粒提取试剂盒和LipofectamineTM 2000转染试剂盒的说明书进行转染。用维持浓度的培养液培养转染的细胞，筛选形成的阳性克隆，挑取阳性克隆进行扩大培养，之后收集细胞进行Northern blotting鉴定。

　　1.2.3 Western blotting 检测蛋白表达

　　将蛋白提取之后，按照蛋白质定量试剂盒(Catalog Number：23250)的说明书进行蛋白定量，将提取蛋白进行Western blotting.

　　1.2.4 RT-PCR检测mRNA表达

　　按照总RNA提取试剂盒(Invitrogen)说明书提取总RNA，运用Beacon Designer 2.0 软件进行引物设计，以(oligo)dT为引物逆转录合成cDNA第一链，以4 μL的cDNA为模板进行PCR扩增，β-actin为内参照.取5 μL PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳。

　　1.2.5 MTT法检测细胞的增殖

　　0.25%胰蛋白酶消化单层培养的T24细胞，用含100 mL/L血清的1640培养基制成单个细胞悬液，以每孔3 × 104个细胞接种于24孔培养板中，每孔培养基600 μL。将细胞放入37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养，待细胞长到50%融合时更换无血清的1640培养基同步化24 h，后加100 mL/L血清，在不同时间段(24， 48， 72 h)测值时往培养板中加入10 × MTT，继续培养4 h，弃去培养基，加入150 μL DMSO，室温孵育10 min，待紫色结晶完全溶解后，用Elx-800酶联免疫检测仪测定A570nm值，以A570nm值代表细胞活力。

　　1.2.6 统计学方法

　　所有实验重复3次，结果以x ± s表示，用SPSS 13.0统计软件进行分析，以P < 0.05为有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 miR-21高表达质粒构建

　　选取经过初步鉴定的阳性克隆进行DNA测序，结果显示插入片段的阅读框正确，所测序列与目的序列一致。

　　2.2 miR-21高表达质粒细胞系的建立

　　2.2.1 G418筛选浓度的测定

　　正常T24进过14 d的加药筛选，结果如图1所示，细胞在加G418筛选到10 d时，G418浓度为1.0 g/L培养液的样品，细胞已经全部死亡。在第14天时，G418浓度为0.6 g/L培养液的细胞样品尚有部分细胞存活， 浓度为0.8 g/L的细胞样品已经被全部杀死。选择0.8 g/L G418培养液的药物浓度为含高表达质粒阳性克隆筛选的加药浓度。

　　2.2.2 含miR-21高表达质粒克隆的筛选

　　用提取的质粒转染T24细胞，24 h后传代，加G418(0.8 g/L培养液)筛选，培养14 d后观察所得结果如图2。正常对照细胞已经全部杀死，转染了质粒的细胞形成了多个不同的阳性克隆，挑取克隆并扩大培养。

　　2.3 稳定表达细胞系中VEGF和AP1表达情况检测

　　2.3.1 稳定表达细胞系VEGF和AP1蛋白质的表达检测

　　将经过鉴定的细胞系进行扩大培养，提取细胞总蛋白，对其进行蛋白定量后。经过电泳、转膜、孵抗、显影后获得如下结果(图3)。结果显示，相对于正常组和空质粒组，转染了pSil-miR-21高表达质粒的T24的VEGF和AP1蛋白表达受到了促进作用，其中VEGF蛋白的表达增加了(6.72 ± 0.92)%(P < 0.05)，AP1蛋白增加了(7.94 ± 1.28)%(P < 0.05)， 而正常组、空质粒组的组间差异无统计学意义(P > 0.05)。

　　2.3.2 miR-21对VEGF和AP1 mRNA表达的影响

　　用AP1 和VEGF基因特异引物进行RT-PCR检测。AP1的PCR条件：94 ℃预变性3 min， 94 ℃变性30 s、61.0 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，30个循环后再72 ℃终末延伸5 min;VEGF的PCR条件：94 ℃预变性4 min， 94 ℃变性1 min、58 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min， 31个循环后再72 ℃终末延伸5 min;GAPDH的PCR条件：94 ℃预变性4 min，然后94 ℃变性1 min、58 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min， 32个循环后再72 ℃终末延伸10 min(图4)。结果显示转染了pSil-miR?鄄21高表达质粒的T24的VEGF和AP1 mRNA受到了不同程度的促进作用，VEGF mRNA的表达增加了(18.90 ± 5.32)%(P < 0.05)， AP1增加了(13.31 ± 6.03)%(P < 0.05)而正常组、空质粒组的组间差异无统计学意义(P > 0.05)。

　　2.4 MTT法检测细胞增殖结果

　　MTT试验结果进行统计，如图5。由结果可知转染了pSil-miR-21高表达质粒的T24的增殖情况受到促进，转染了pSil?鄄miR-21的细胞增殖效果最强[48 h，增殖率(13.43 ± 3.17)%，P < 0.05]。

　　3 讨 论

　　3.1 miR-21与癌症

　　大量的资料显示，miR-21在肝癌、肺腺癌、乳腺癌等肿瘤中发现具有一定的调节作用。Meng等[11]使用miRNA微阵列研究发现，miR-21在肝癌肿瘤细胞株中过表达，抑制培养的肝癌细胞中miR-21的表达，则磷酸酶和同源张力蛋白(PTEN)肿瘤抑制基因增加，肿瘤细胞的增殖、迁移和入侵能力下降。此外，在正常的人肝细胞转染前体miR-21后，细胞迁移增加。 Schetter等[12]通过原位杂交表明miR-21在结肠癌细胞中的表达水平很高，高表达的miR-21与差的存活和治疗结果有关。Frankel等[13]发现MCF-7乳腺癌细胞中，miR-21受到抑制是细胞生长减少的原因。实验还发现，肿瘤抑制蛋白——细胞程序性死亡4(PDCD4)受miR-21调节，证明在乳腺癌细胞中，PDCD4是miR-21的一个重要的功能性靶点。

　　3.2 miRNA与膀胱癌

　　miR-21在膀胱癌发生发展中的作用研究较少。Dyrskj?覬t等[14]对106个膀胱癌组织和11个正常组织进行寡聚核苷酸分析，相对于正常组织，膀胱癌组织中miR-145下调最显著，miR-21上调最显著。Lin等[15]通过实验发现，相对于正常膀胱上皮组织，膀胱癌的miRNA表达图谱显示37种miRNA上调，38种miRNA下调，其中miR-143在肿瘤中的表达是低于正常组织的13.7倍。微阵列分析，RNA印迹分析和实时PCR反应都证实了miR-143的显著下调表达。在转染了miR-143的细胞中，RAS蛋白的表达显著下降。实验证实microRNA在膀胱癌中异常表达，提示miR-143可能在在膀胱癌中作为一种肿瘤抑制因子。我们课题组对膀胱癌的研究表明，miR-21对膀胱癌细胞具有一定的调节作用，高表达的miR-21细胞系中细胞的增殖速度加快，提示miR-21可以促进膀胱癌细胞的增殖。

　　3.3 VEGF和AP1在癌症中的作用

　　VEGF是血管新生的关键因素，它通过调控病理性血管发生和增加血管通透性而起作用，在人类各种肿瘤组织中，如膀胱癌、宫颈癌、乳腺癌、大肠癌等，都有高水平的VEGF表达。AP1是一种转录因子，通过bZIP结构域的碱性区域与DNA序列结合，调节基因的转录，参与细胞的增殖、分化过程。 AP1在肿瘤形成及发展过程中，通过促进细胞增殖、抑制分化、促进肿瘤细胞的侵袭和转移等过程发挥作用参与转化、增殖、分化、凋亡等多种生物学功能[16]。研究表明AP1的活化参与了VEGF和bFGF的异常表达，参与恶性肿瘤的转移过程[17]。在我们的实验中发现，miR-21高表达质粒组的VEGF和AP1蛋白受到促进作用，实验结果提示在T24细胞中，VEGF和AP1可能是miR-21发挥作用的重要蛋白。

　　3.4 问题与展望

　　本研究中有如下几个问题需要解决：①本实验的质粒转染过程中，我们分别采用了瞬时转染和稳转两种方法，且质粒带有荧光标记，但是两种方法的效果相差较大。可能是因为瞬时转染时间短，且对细胞的伤害较大，所以目的蛋白的表达不明显。但是后期稳转建立的细胞系比较稳定，达到了预期的效果。②从TargetScanHuman 5.1上，我们可以发现，miR-21预期的靶位点上没有AP1和VEGF，然而我们的实验结果却显示，miR-21对AP1和VEGF具有调节作用，这提示miRNAs的作用可能是网络式的，具有一定的协调作用，单独的研究某一个miRNA可能具有一定的孤立性。

　　在本实验中的重要发现之一是miR-21在T24人膀胱癌细胞中对AP1和VEGF具有明显的调节作用，过表达的miR-21能够促进AP1和VEGF的表达;我们的进一步实验还发现，miR-21高表达质粒组的T24细胞增殖速率受到了不同程度的促进。研究microRNA对某些特定基因的调节作用，对于我们进一步阐明发病机制开拓了新的领域。通过调节某些关键性的microRNA从而实现调控某些膀胱癌关键基因的目的，是膀胱癌疾病研究的重要突破，为临床上针对膀胱癌疾病寻找以microRNA为靶标的新型药物提供理论依据。

　　【参考文献】

　　李晓霞，李瑞平，杜紫明，等. 鼻咽癌差异表达miRNAs筛选研究 [J]. 中山大学学报： 医学科学版， 2007， 28(6)： 607-612.

　　Cho WC， Chow AS， Au JS. Restoration of tumour suppressor hsa-miR-145 inhibits cancer cell growth in lung adenocarcinoma patients with epidermal growth factor receptor mutation [J]. Eur J Cancer， 2009， 45(12)： 2197-2206.

　　Zhao Y， Samal E， Srivastava D. Serum response factor regulates a muscle-specific microRNA that targets Hand2 during cardiogenesis [J]. Nature， 2005， 436(18)： 214-220.

　　Ji R， Cheng Y， Yue J， et al. MicroRNA expression signature and antisense-mediated depletion reveal an essential role of microRNA in vascular neointimal lesion formation [J]. Circ Res， 2007， 100(23)： 1579-1588.

　　He A， Zhu L， Gupta N， et al. Overexpression of micro ribonucleic acid miR-29，highly up-regulated in diabetic rats， leads to insulin resistance in 3T3-L1 adipocytes [J]. Mol Endocrinol， 2007， 21 (11)： 2785-2794.

　　Agius E， Oelgeschlager M， Wessely O， et al. Endodermal Nodal-related signals and mesoderm induction in Xenopus [J]. Development， 2000， 127(6)： 1173-1183.

　　Martello G， Zacchigna L， Inui M， et al. MicroRNA control of Nodal signalling[J]. Nature， 2007， 449(7159)： 183-188.

　　Gottardo F， Liu CG， Ferracin M， et al. Micro-RNA profiling in kidney and bladder cancers[J]. Urol Oncol， 2007， 25(5)： 387-392.

　　Frankel LB， Christoffersen NR， Jacobsen A， et al. Programmed Cell Death 4 (PDCD4) Is an Important Functional Target of the MicroRNA miR-21 in Breast Cancer Cells [J]. J Biol Chem， 2008， 283(2)： 1026-1033.

　　Li W， Xie L， He X， et al. Diagnostic and prognostic implications of microRNAs in human hepatocellular carcinoma [J]. Int J Cancer， 2008， 123(7)： 1616-1622.

　　Meng F， Henson R， Wehbe-Janek H， et al. MicroRNA-21 regulates expression of the PTEN tumor suppressor gene in human hepatocellular cancer[J]. Gastroenterology， 2007， 133(2)： 647-658.

　　Schetter AJ， Leung SY， Sohn JJ， et al. MicroRNA expression profiles associated with prognosis and therapeutic outcome in colon adenocarcinoma[J]. JAMA， 2008， 299(4)： 425-436.

　　Frankel LB， Christoffersen NR， Jacobsen A， et al. Programmed cell death 4 (PDCD4) is an important functional target of the MicroRNA miR-21 in breast cancer cells [J]. J Biol Chem， 2008， 283(2)： 1026-1033.

　　Dyrskj?覬t L， Ostenfeld MS， Bramsen JB， et al. Genomic profiling of microRNAs in bladder cancer： miR-129 is associated with poor outcome and promotes cell death in vitro [J]. Cancer Res， 2009， 69(11)： 4851-4860.

　　Lin T， Dong W， Huang J， et al. MicroRNA-143 as a tumor suppressor for bladder cancer [J]. J Urol， 2009， 181(3)： 1372-1380.

　　Janulis M， Silberman S， Ambegackar A， et al. Role of mitogen-activated protein kinases and c-Jun/AP-1 trans-activating activity in the regulation of protease mRNAs and the malignant phenotype in NIH 3T3 fibroblasts [J]. J Biol Chem， 1999， 274(2)： 801-813.

　　Silins G， Grimmond S， Egerton M， et al. Analysis of the promoter tegion of the human VEFG-related factor gene [J]. Biochem Biophys Res Commun， 1997， 230(2)： 413-418.