5AzaCdR对肾细胞癌Caki1细胞生长及E钙黏蛋白基因表达的影响

　　作者：何鸿保,孙浩,姚宏伟,唐爱国　　作者单位：江苏大学附属医院泌尿外科

　　【摘要】目的:研究甲基化抑制剂5氮杂2′脱氧胞苷(5 AzaCdR)对肾细胞癌细胞株Caki1增殖抑制作用、对E钙黏蛋白(Ecadherin，Ecad)甲基化状态及Ecad蛋白状态的影响。方法： 不同浓度5AzaCdR处理肾细胞癌细胞株Caki1后，四甲基偶氮唑盐(MTT)比色实验观察细胞经药物处理前后的生长活性;甲基化特异性PCR(methylation special PCR，MSP)检测细胞处理前后Ecad基因的甲基化状态;蛋白质印迹法检测5AzaCdR处理细胞前后Ecad蛋白的表达。结果： 5AzaCdR能抑制肾细胞癌细胞株Caki1的增殖;未经药物处理组的基因高甲基化，经10-6 mol/L 5AzaCdR处理72 h，Ecad基因启动子区域高甲基化得到逆转，同时Ecad蛋白表达也得到增强。结论： 5AzaCdR能够有效逆转Caki1细胞Ecad基因的异常甲基化，恢复Ecad蛋白表达。

　　【关键词】5氮杂2′脱氧胞苷;肾细胞癌;E钙黏蛋白;DNA甲基化;

　　[Abstract] Objective: To investigate the effects of methylation inhibitor 5Aza2′deoxycytidine on the growth of renal clear cell carcinoma cell line Caki1 and the expression of the Ecadherin(Ecad) gene and protein. Methods: Renal clear cell carcinoma cell line Caki1 were treated with different concentration of 5AzaCdR respectively. Then the growth rate of the cells was detected by MTT assay. The methylation and demethylation status of Ecad gene were detected by methylation special PCR(MSP).The western blot was used to detect Ecad protein levels in the cell line before and after treatment with 5AzaCdR. Results: 5AzaCdR can inhibit the growth of renal clear cell carcinoma Caki1.The high methylation status of Ecad gene promoter region was reversed with 10-6 mol/L 5AzaCdR treated for 72 h， while Ecad protein expression was also enhanced. Conclusion: 5AzaCdR effectively caused the demethylation of Ecad gene， and recovered the Ecad protein expression.

　　[Key words] 5Aza2′deoxycytidine;renal clear cell carcinoma;Ecadherin;DNA methylation

　　肾细胞癌的发病率居泌尿系统肿瘤的第二位，目前的治疗仍以根治性手术为主，但术后复发率达20%以上，且放化疗效果不佳，因此迫切需要早期诊断方法和其他有效的治疗。肾细胞癌的发生、发展与多种因素有关，抑癌基因失活是关键因素之一，抑癌基因失活的主要方式有基因的缺失、突变和启动子区域的过甲基化等[1]。研究发现，E钙黏蛋白(Ecadherin，Ecad)是一类介导细胞之间互相黏附的钙依赖性跨膜糖蛋白，它在胚胎发育、形态发生、上皮极性和完整性维持等方面起着重要作用[2]。近年来研究表明，Ecad和肿瘤细胞浸润、转移有着重要关系，其在胃癌、肠癌、前列腺癌及乳腺小叶癌组织中表达下调，Ecad基因启动子甲基化是其表达缺失的主要原因[3]。DNA 甲基化是一种发生在CpG二核苷酸上对胞嘧啶的共价修饰，是基因在转录水平的调控方式之一，它不存在 DNA 序列改变，是表观遗传学的一种[4]。为探讨Ecad基因甲基化与肾细胞癌的关系及临床意义，我们进行了相关研究，现报告如下。

　　1 材料和方法

　　1.1 材 料

　　牛血清(杭州四季青公司);McCoy′s 5A培养基(美国Invitrogen公司)、胰酶(武汉博士德公司); 5氮杂2′脱氧胞苷(5AzaCdR)、四甲基偶氮唑盐(MTT)及二甲基亚砜(DMSO)(美国Sigma公司)，5AzaCdR用培养基充分溶解后保存于-70 ℃冰箱备用;通用DNA提取试剂盒3.0及TaKaRa Ex Taq(大连宝生物工程有限公司);DNA甲基化修饰试剂盒(北京天漠科技开发有限公司);鼠抗人一抗、羊抗鼠二抗(美国赛信通公司)。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 肾细胞癌细胞株的培养

　　肾细胞癌细胞株Caki1购于上海中科院细胞库，培养于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素的McCoy′s 5A培养基中，饱和湿度，37 ℃，5% CO2孵育箱中，每3天更换培养液1次，待细胞铺满底壁的85%～90%时，按1∶2传代，取呈对数生长期的细胞用于实验。

　　1.2.2 MTT实验检测细胞增殖活性

　　取呈对数生长期细胞以每孔2 500个细胞密度接种于4块96孔板中，过夜贴壁后，加入含有5AzaCdR不同终浓度的培养基，每孔200 μl，每组设3个复孔，并设不加药的对照孔和不接种细胞的调零孔。药物和培养液每24 h更换1次，每天取出1板，加入5 g/L的MTT溶液20 μl，37℃，5%CO2培养箱中继续培养4 h后弃去上清，每孔加入150 μl DMSO，振荡10 min充分溶解结晶，置酶联免疫检测仪上测定在波长490 nm处的光密度值，细胞生存率以平均光密度值分析，以时间为横坐标，以平均光密度值为纵坐标，绘制生长曲线图。

　　1.2.3 DNA特异性甲基化PCR(MSP)检测CpG岛甲基化

　　取用10-6 mol/L的5AzaCdR处理72 h细胞以及未经药物处理的对照组细胞，按DNA提取试剂盒说明书(大连TaKaRa公司)提取各组DNA，基因组DNA中富含CG区的异常甲基化首先要经过亚硫酸氢钠化学修饰作用， 使未甲基化的胞嘧啶(C)变为尿嘧啶(U)，而已甲基化的胞嘧啶(Cm)则不会改变。采用甲基化修饰试剂盒(北京天漠科技公司)处理已提取的各样本DNA。DNA甲基化特异性聚合酶链反应：根据文献[5]合成寡核苷酸引物(上海生工生物工程有限公司合成)，引物序列，EcadM，5′TTAGGTTAGAGGGTTATcGCGT3′(正义)，5′TAACTAAAAATTCACCTACCGAC3′(反义)，扩增产物片段长度116 bp。PCR反应条件，95℃预变性10 min，95℃变性30 s，57℃退火45 s;72℃延伸30 s，共35个循环后，72 ℃延伸10 min;EcadU，5′TAATITTAGGTTAGAGGGTTATTGT3′(正义)，5′CACAACCAATCAACAACACA3 ′(反义)，扩增产物片段长度97 bp。反应条件，95 ℃预变性10 min，95度变性30 s，53 ℃退火45 s;72 ℃延伸30 s，共35个循环后，72 ℃延伸10 min。EcadM和EcadU分别用于扩增Ecad基因CpG岛甲基化和非甲基化的等位基因。扩增产物于2.5 g/L琼脂糖凝胶电泳，紫外线凝胶成像系统采集图像，根据DNA条带判断结果。

　　1.2.4 蛋白质印迹法检测5AzaCdR干预前后Ecad 蛋白的表达变化

　　取用10-6 mol/L的 5AzaCdR处理72 h的实验组细胞和未经药物处理的对照组细胞，严格按照膜提取试剂盒操作说明书(上海贝博膜蛋白提取试剂盒)提取Ecad蛋白，用BCA法对所提取的蛋白进行定量。膜在一抗Ecad单克隆抗体中室温下孵育2 h，PBS洗涤加二抗室温下2 h，碱性磷酸酶染色，自动电泳凝胶成像分析系统下成像。

　　1.2.5 统计学处理

　　采用 SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析，进一步两两比较采用LSDt检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 不同浓度 5AzaCdR处理后Caki1细胞的增殖活性

　　MTT检测结果显示，时间不变，5AzaCdR对Caki1增殖的抑制率随浓度的增大而增强，且不同浓度组间的抑制率比较差异有统计学意义(P<0.05);浓度不变，5AzaCdR 对Caki1增殖的抑制率随时间延长而增强，且不同作用时间的组间抑制率比较差异有统计学意义(P<0.05) 。见图1。图1 不同浓度5AzaCdR处理细胞Caki1的增殖曲线

　　2.2 5AzaCdR对Caki1细胞Ecad基因甲基化状态的影响

　　未经药物处理的Caki1细胞中Ecad基因显示高甲基化，而经过药物处理的也有甲基化条带的出现，但明显低于对照组;经5AzaCdR 处理的非甲基化引物扩增片段的强度明显高于对照组，表明Ecad基因高甲基化发生了逆转。见图2。M：DNA Ladder 2000;1，2：对照组非甲基化产物;3，4：实验组非甲基化产物图2 甲基化特异性PCR检测Ecad基因　　的甲基化状态

　　2.3 5AzaCdR对Caki1细胞Ecad蛋白表达的影响

　　蛋白质印迹检测显示，β肌动蛋白和Ecad特异性免疫印迹条带的相对分子质量分别为124 000和43 000，对照组和实验组的β肌动蛋白表达基本一致，而未经5AzaCdR处理的对照组细胞Ecad蛋白表达明显低于经过5AzaCdR处理72 h的实验组的蛋白表达，说明5AzaCdR可以上调Ecad蛋白的表达。见图3。图3 蛋白质印迹检测Ecad蛋白的表达

　　3 讨 论

　　浸润和转移是肾癌重要的生物学特征，也是造成临床上肾癌患者治疗失败的主要原因。肿瘤细胞从原发部位脱落是肿瘤转移的始动环节，这一过程与细胞黏附功能降低密切相关。Ecad是一类主要介导细胞间同质黏附的钙依赖性跨膜糖蛋白，是细胞黏附分子中的一种。人类的Ecad编码基因定位于16号染色体q22.1附近，由723～748个氨基酸组成，包括N端胞外区、高度疏水的跨膜区及C端胞内区[6]。钙离子依赖性黏附素分子家族是一类重要的细胞间黏附分子，其中上皮性钙离子依赖的黏附素分子Ecad是维持正常上皮细胞间黏附的重要分子，Ecad表达降低将导致肿瘤细胞浸润生长和由原发灶脱落转移，是多种肿瘤侵袭及转移的主要因素[7]，因此研究肾癌组织中Ecad分子表达的改变及其机制对于了解肾癌的转移机制和指导临床治疗可能具有一定的价值。

　　DNA甲基化在肿瘤相关基因表达中具有重要作用，它可以通过基因启动子及其附近区域内CpG岛胞嘧啶的甲基化关闭某种组织或细胞不必要的基因，使之不表达或沉默。研究表明，抑癌基因的失活和表达降低与其启动子区域的高甲基化状态有关[4，8]，DNA 高甲基化是引起抑癌基因失活的重要方式，是部分碱基对发生甲基化修饰，这种异常的甲基化模式是可以逆转的[9]。5AzaCdR是一种特异性甲基转移酶抑制剂，在DNA 复制过程中与DNA分子相结合，并与DNA甲基转移酶1形成共价复合物，抑制该酶的甲基转移活性，而实现去甲基化功能，恢复基因的重新表达，由于5AzaCd可使抑癌基因甲基化的状态消失，所以可以应用于某些调节基因沉默的肿瘤治疗[10]。

　　本实验采用5AzaCdR处理Caki1后，MTT检测细胞的生长曲线，可以看出细胞生长受到不同程度的抑制，呈时间和剂量依赖性。未经5AzaCdR处理的Caki1细胞中Ecad基因启动子区域显示为高甲基化状态，而经5AzaCdR处理后，5AzaCdR基因启动子区域高甲基化状态得到逆转，提示5AzaCdR可逆转Ecad基因高甲基化状态而抑制Caki1肾细胞癌细胞株增殖。蛋白质印迹结果表明经5AzaCdR处理后，Ecad蛋白表达也增强。提示Ecad基因启动子CpG岛甲基化可能参与肾癌的发生以及转移。在国外，5AzaCdR已经用于临床治疗白血病，提示可进一步探讨Ecad基因甲基化与肾癌的发病机制及肾癌进展、预后之间的关系，为探讨肾细胞癌发病机制及寻求临床治疗新靶点提供理论依据。

　　【参考文献】

　　[1] 陶美满,孙浩,田福起，等. 5AzaCdR对人肾癌OSRC2细胞生长及γ连环蛋白表达的影响[J]. 江苏大学学报：医学版, 2009,19(3): 253-255.

　　[2] van Roy F, Berx G, et al. The cellcell adhesion molecule Ecadherin[J]. Cell Mol Life Sci, 2008，65(23): 3756-3788.

　　[3] Yap AS, Crampton MS, Hardin J, et al. Making and breaking contacts: the cellular biology of cadherin regulation[J]. Curr Opin Cell Biol, 2007，19(5): 508-514.

　　[4] Szyf M. DNA methylation and demethylation probed by small molecules[J]. Biochim Biophys Acta, 2010，1799(10-12):750-759.

　　[5] Chen CL, Liu SS, Wong LC, et al. Ecadherin expression is silenced by DNA methylation in cervical cancer cell lines and tumours[J]. Eur J Cancer, 2003，39(4): 517-523.

　　[6] Berx G, van Roy F. Involvement of members of the cadherin superfamily in cancer[J]. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2009,1(6): a003129.

　　[7] Beavon IR. The Ecadherincatenin complex in tumour metastasis: structure, function and regulation[J]. Eur J Cancer, 2000,36(13): 1607-1620.

　　[8] Szyf M. DNA methylation and demethylation as targets for anticancer therapy[J]. Biochemistry(Mosc), 2005,70(5): 533-549.

　　[9] Auerkari EI. Methylation of tumor suppressor genes p16(INK4a), p27(Kip1) and Ecadherin in carcinogenesis[J]. Oral Oncology, 2006,42(1): 5-13.

　　[10] Nam JS, Ino Y, Kanai Y, et al. 5Aza2′deoxycytidine restores the Ecadherin system in Ecadherinsilenced cancer cells and reduces cancer metastasis[J]. Clin Exp Metastasis, 2004,21(1): 49-56.