蛋白激酶抑制剂PKC412对膀胱癌T24细胞生长增殖的影响

　　作者：张建国1 ， 苏昀2　 作者单位：(1.江苏大学附属医院ICU， 江苏 镇江 212001; 2.东南大学附属中大医院泌尿外科， 江苏 南京 210009)

　　【摘要】 目的： 观察蛋白激酶C(PKC)抑制剂N苯甲酰星孢菌素(PKC412)对膀胱癌T24细胞株生长、增殖、侵袭功能和细胞周期的影响。方法： 用不同浓度PKC412(0.01,0.1,1.0,10 μmol/L)作用于对数生长期T24细胞24,48,72 h。采用软琼脂克隆形成试验测定T24细胞克隆形成抑制率，MTT法检测细胞生长抑制率，Transwell小室法检测细胞的侵袭能力，流式细胞术分析细胞周期的变化。结果： 当PKC412浓度从0.01 μmol/L增加到10 μmol/L时，T24细胞克隆形成抑制率从-0.62%增加到80.46%，细胞生长抑制率从1.17%增加到73.62%，细胞侵袭抑制率从1.8%增加到73.72% (P<0.05)，均呈时间和剂量依赖性。PKC412作用48 h后，随着浓度的增加，G2/M期细胞比例从12.26%增加到58.41%，呈G2/M期细胞阻滞。结论： PKC412对体外培养的T24细胞克隆形成、生长和侵袭具有抑制作用，其机制与G2/M期细胞阻滞有关。

　　【关键词】 膀胱癌;N苯甲酰星孢菌素;克隆;侵袭;细胞周期

　　[Abstract]　Objective： To investigate the growth ， proliferation， invasive function and the influence of the cell cycle of PKC412 on T24 bladder cancer in vitro. Methods： With different concentrations of PKC412 ( 0.01， 0.1， 1， 10 mol/L )acted on the T24 cell after 24， 48， 72 h; using soft agar clonogenic assay to determine the cell colony formation inhibition rate of T24， MTT method was used to detect the cell growth inhibition rate. The invasion ability of T24 was assayed by Transwell cell， the cell cycle changes were analysed by flow cytometric. Results： The inhibition rate of T24 cell clone forming from -0.62% increased to 80.46% ， when PKC412 concentration increased from 0.01 μmol/L to 10 μmol/L; cell growth inhibition rate increased from 1.17% to 73.62%， the cells invasive inhibition rate increased from 1.8% to 73.72%. All inhibitions were in a time-and-dose dependent manners. After PKC412 acting 48 hours， with the increasing of concentration， G2/M period cells from 12.26% increased to 58.41% ， showed the G2/M period cell block. Conclusion： PKC412 decreased cell growth，invasion and inhibited cloning formation of human bladder cancer cell T24 in vitro.

　　[Key words]　bladder cancer; N-benzoyl-staurosporine; clone; invasion; cell cycle

　　目前人们逐渐意识到化疗药物并不能使转移性膀胱癌的预后产生质的改变，因此学者们试图从基因和蛋白水平寻找诊断并治疗膀胱癌的可行性。N苯甲酰星孢菌素(N-benzoyl-staurosporine，PKC412)是十字孢碱(Staurosporine，SP)的衍生物，是一种广谱蛋白激酶C(protein kinase C， PKC)抑制剂，它能抑制ATP与PKC尤其是传统型PKC的结合，其靶向目标包括PKC、血管内皮生长因子受体(VEGFR)，血小板衍化生长因子受体(PDGFR)，c-kit、酪氨酸激酶受体FLT-3[1-3]。PKC412显示了对各种肿瘤细胞广泛的抗增殖作用以及降低肿瘤细胞的多药耐药(multidrug resistance，MDR)作用[4-5]。然而目前尚未有PKC412对膀胱癌的影响相关研究报道。我们采用人膀胱癌T24细胞系为靶目标，通过检测PKC412对T24细胞克隆形成、生长、侵袭和细胞周期等方面的影响，探讨PKC412对膀胱癌的治疗是否具有潜在的有益作用。

　　1　材料与方法

　　1.1　材　料

　　人膀胱移行细胞癌T24细胞株(以下简称T24)购自中国科学院上海细胞生物研究所。PKC412购自美国LC实验室，Matrigel购自美国BD公司，Transwell 培养小室购自美国Corning公司，RPMI-1640培养粉、精制胰蛋白酶和低熔点琼脂购自美国Gibco公司，噻唑蓝(MTT)购自美国Sigma公司，纤维连接蛋白(FN)购自美国Gibco BRL公司，小牛血清白蛋白购自上海生工生物工程有限公司，细胞周期试剂盒购自中国凯基公司。

　　1.2　实验方法

　　1.2.1　细胞培养

　　人膀胱癌T24细胞在含青霉素(100 U/ml)、链霉素(100 mg/L)和10%胎牛血清的RPMI-1640液中，置37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱中孵育，待用。

　　1.2.2　MTT法检测体外细胞生长情况

　　取对数生长期T24细胞，0.25%胰酶消化，制成4×104/ml的单细胞悬液，接种于96孔培养板，200 μl/孔，培养24 h，吸净培养液，分别加入不同浓度PKC412(0.01、0.1、1.0、10 μmol/L) 200 μl作用24 h后取出一板，加入MTT,20 μl/孔。培养4 h后，吸净培养液，加入DMSO 150 μl/孔，振荡溶解10 min，使结晶物充分溶解。酶标仪测波长490 nm处光密度(D)值，计算生长抑制率。抑制率=(1-D处理组/ D对照组)×100%。在PKC412作用48 h、72 h后再分别测定并计算PKC412对T24细胞的生长抑制率。

　　1.2.3　软琼脂克隆形成试验

　　取对数生长期细胞制成4×104个/ml细胞悬液，接种于96孔培养板，200 μl/孔，培养箱内过夜，分别加入不同浓度PKC412(0.01、0.1、1.0、10 μmol/L) 200 μl ，在37℃、5%CO2及饱和湿度的培养箱中孵育24 h后，用0.25%胰蛋白酶消化，调整细胞密度至1×103/ml待用。取5%琼脂置沸水浴中使之完全溶化，取出一份，冷至50℃，加入9份预温37℃的新鲜RPMI-1640完全培养液，混匀，浇入24孔培养板中，每孔1 ml，置于室温使琼脂凝固备用。取37℃保温的1×103/ml的细胞悬液9.4 ml移入烧杯，加50℃的5%琼脂0.6 ml，迅速混匀，配成0.3%琼脂培养基，浇入铺有底层琼脂的24孔培养板中，每孔1 ml，置室温凝固。把24孔培养板移入CO2培养箱，在37℃、5%CO2及饱和湿度环境中培养2周。显微镜计数含有50个细胞以上的克隆数。克隆抑制率=(处理组克隆数-对照组克隆数)/对照组克隆数×100%。在处理因素作用48、72 h后再分别测定PKC412对T24细胞的克隆形成抑制率。

　　1.2.4　Transwell小室法检测细胞侵袭能力

　　实验前晚将保存在-20℃的基质胶转移至4℃冰箱，使其完全溶解。所有与基质胶接触的实验用品在实验前置于-20℃冰箱冷冻1 h。在Transwell小室膜的外面涂纤维连接蛋白5 μg(10 μl)，置超净台室温下风干;膜的内面涂基质胶15 μg(10 μl)，形成一个基质屏障层，室温下干燥。24孔培养板内加入0.1%BSA-RPMI 1640无血清培养基，每孔600 μl。取对数生长期细胞，胰酶消化，悬浮于含0.1%BSA-RPMI 1640无血清培养基中，终浓度为2×l05/ml，培养基内分别加入不同浓度PKC412(0.01、0.1、1.0、10 μmol/L) 200 μl。细胞悬液加到Transwell细胞培养小室中，每小室100 μl。将小室浸于24孔板的培养基中，37℃，5%CO2培养箱内孵育24 h后将小室取出，滤膜用甲醇固定10 min。弃去固定液，加姬姆萨应用液染色10～30 min。用棉签擦掉未穿过膜的细胞(滤膜上层细胞)。于400倍显微镜下计数侵袭细胞数。每膜计数上下左右中5个不同视野的透膜细胞数，求其总数，以透膜细胞的相对数目来表示肿瘤细胞的侵袭力。在PKC412作用48 h、72 h后再分别测定T24透膜细胞数目。侵袭抑制率=(1-处理组透膜细胞数/对照组透膜细胞数)×100%。

　　1.2.5　细胞周期检测

　　取对数生长期T24细胞，制成单细胞悬液，5×106万/孔接种于6孔板中，置37℃，5%CO2饱和湿度培养箱内培养24 h后，加入不同浓度PKC412(0.01、0.1、1.0、10 μmol/L) 200 μl ，置培养箱内继续培养48 h后取出，0.25%胰酶消化细胞，取(1～2)×106细胞置入EP管中，1 000 r/min离心5 min，弃去培养液用PBS洗1次，离心弃去PBS，加入20 μl PBS制成单细胞悬液，吸取细胞悬液迅速吹入70%预冷的乙醇中振荡混匀，4℃冰箱固定过夜。离心弃去固定液，用1 ml PBS重悬，离心，弃去上清，加入10 μl RNA酶，吹散细胞，置37℃水浴30 min。加入40 μl碘化丙啶(PI)染液，4℃冰箱避光染色30 min后上机检测。

　　1.3　统计学方法

　　采用SPSS10.0统计软件分析数据，数据以x±s表示，用t检验及单因素方差分析， P<0.05为差异有统计学意义。

　　2　结　果

　　2.1　PKC412对T24细胞克隆形成的影响

　　DMSO组在24 h,48 h,72 h的抑制率分别是1.25%，-2.22%,1.02%，与培养液对照组比较，P值均大于0.05，提示作为溶剂的DMSO对T24克隆形成的能力无影响。当PKC412浓度从0.01 μmmol/L上升到10 μmol/L，作用时间从24 h上升到72 h，T24细胞的克隆形成抑制率从-0.62%上升到80.46%。经方差分析，与培养液对照组比较不同浓度下的克隆形成数有显著差异(P<0.01);不同时间克隆形成数亦有显著差异(P<0.01)。PKC412对T24细胞的克隆形成抑制作用呈时间和剂量依赖关系。见表1。表1　PKC412对T24细胞克隆形成能力的抑制作用

　　2.2　PKC412对T24细胞生长的影响

　　MTT试验显示DMSO组在24 h,48 h,72 h的抑制率分别是0.59%,2.94%,1.33%，与培养液对照组比较，P值均大于0.05，提示作为溶剂的DMSO对T24细胞生长无影响。当PKC412浓度从0.01 μmmol/L上升到10 μmol/L，作用时间从24 h上升到72 h，T24细胞的生长抑制率从1.17%上升到73.62%。经方差分析，与培养液对照组比较，不同浓度下的生长抑制率差异有统计学意义(P<0.01)，不同时间上生长抑制率差异亦有统计学意义(P<0.01)。PKC412对T24细胞的生长抑制呈时间和剂量依赖关系。见表2。表2　PKC412对T24细胞存活和生长的抑制作用

　　2.3　PKC412对T24细胞侵袭的影响

　　Transwell侵袭试验显示DMSO组在24 h,48 h,72 h的抑制率分别是-1.80%,4.49%，-2.12%，与培养液对照组比较，P值均大于0.05，提示作为溶剂的DMSO对T24侵袭能力无影响。当PKC412浓度从0.01 μmmol/L上升到10 μmol/L，作用时间从24 h上升到72 h，T24细胞的透膜抑制率从1.80%上升到73.72%。经方差分析，与培养液对照组比较不同浓度下的侵袭抑制率差异有统计学意义(P<0.01)，不同时间上差异亦有统计学意义(P<0.01)。因此，PKC412对T24细胞侵袭能力的抑制呈时间和剂量依赖关系。见表3。表3　PKC412对T24细胞侵袭能力的抑制作用

　　2.4　PKC412对T24细胞周期的影响

　　DMSO对照组G0/G1期细胞比例为74.52%，G2/M期细胞比例为7.25%;PKC412浓度为0.01,0.1,1.0,10.0 μmol/L时，G0/G1期细胞比例逐渐下降，分别为70.22%、62.40%、41.08%和38.23%;而G2/M期细胞比例逐渐升高，分别为12.26%，17.71%，52.92%和58.41%。提示PKC412具有G2/M期阻滞作用，随着PKC412浓度的升高而增强。见图1。图1　流式细胞术测定PKC412作用48 h后T24细胞周期变化

　　3　讨　论

　　PKC412目前在临床上主要用于白血病的治疗[1]，研究发现PKC412能够促进紫杉醇对宫颈癌的疗效，同时还可以预防因为药物引起的免疫抑制[5]，另外PKC412还能够增加肺癌细胞对依托泊苷和放疗的敏感性[6]。

　　本研究发现PKC412能够抑制体外膀胱癌细胞T24的生长和克隆形成，呈时间和剂量依赖关系。这与El Fitori等[4]的研究结果一致，他们采用细胞计数、MTT法、软琼脂克隆形成法检测PKC412对胰腺癌细胞的抑制作用，发现PKC412能抑制胰腺癌细胞的生长和增殖，呈时间和剂量依赖性，半数抑制浓度在0.25～20 μmol/L之间。

　　癌转移动态过程大致为癌细胞侵袭基底膜、细胞增殖、新生血管生长、形成微小转移灶、肿瘤血管生成、转移灶增殖发展[7]。我们采用Transwell小室法发现PKC412能抑制T24细胞的体外侵袭能力。El Fitori等把胰腺癌细胞接种于裸鼠皮下，采用标记血管内皮和微血管密度分析方法，发现经PKC412处理的胰腺癌组织的微血管密度较对照组明显减小，提示PKC412在体内确实具有抑制血管生成的作用。

　　我们采用流式细胞术周期测定法发现PKC412能把T24细胞周期阻滞在G2/M期，阻止有丝分裂进行，从而抑制了细胞的生长和增值，最终导致细胞的凋亡。但是Aaltonen等[8]使用PKC α/β抑制剂Go6976处理膀胱癌5637细胞，发现Go6976能促进被多柔比星和紫杉醇处理过的5637细胞的有丝分裂，增强药物的细胞毒性作用。他们认为此作用是通过抑制细胞的多药物抵抗和(或)废除G2期检验点来实现的。PKC412是否具有类似作用还需进一步证实。

　　通过本研究，我们发现PKC412具有抑制膀胱癌细胞T24体外生长、克隆形成和侵袭的能力，而且能把细胞周期阻滞在G2/M期。PKC412有可能在抑制膀胱癌生长、预防膀胱癌转移等方面成为有效的辅助药物或新型的抗癌药物。

　　【参考文献】

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　　[ 2 ]　Monnerat C， Henriksson R， Le Chevalier T， et al. Phase Ⅰstudy of PKC412(N-benzoyl-staurosporine)， a novel oral protein kinase C inhibitor， combined with gemcitabine and cisplantin in patients with non-small-cell lung cancer[J].Ann Oncol,2004,15(2)：316-323.

　　[ 3 ]　Fischer T， Stone RM， Deangelo DJ， et al. Phase IIB trial of oral Midostaurin (PKC412)， the FMS-like tyrosine kinase 3 receptor (FLT3) and multi-targeted kinase inhibitor， in patients with acute myeloid leukemia and high-risk myelodysplastic syndrome with either wild-type or mutated FLT3[J]. J Clin Oncol， 2010， 28(28)： 4339-4345.

　　[ 4 ]　El Fitori J， Su Y， Büchler P， et al. PKC412 small-molecule tyrosine kinase inhibitor：single-compound therapy for pancreatic cancer[J]. Cancer， 2007,110(7)： 1457-1468.

　　[ 5 ]　Kim M， Park IY， Lim J， et al. Antitumor and normal cell protective effect of PKC412 in the athymic mouse model of ovarian cancer[J].Ann Clin Lab Sci,2006， 36(4)：455-600.

　　[ 6 ]　Hemstrm TH， Joseph B， Schulte G， et al. PKC412 sensitizes U1810 non-small-cell lung cancer cells to DNA damage[J]. Exp Cell Res， 2005,305(1)： 200-213.

　　[ 7 ]　Huang YC， Shieh HR， Chen YJ. Midostaurin (PKC412) modulates differentiation and maturation of human myeloid dendritic cells[J]. Toxicol In Vitro,2010， 24(6)： 1705-1710.

　　[ 8 ]　Aaltonen V， Koivunen J， Laato M， et al. PKC inhibitor Go6976 induces mitosis and enhances doxorubicin-paclitaxel cytotoxicity in urinary bladder carcinoma cells [J]. Cancer Lett， 2007， 253(1)： 97-107.