神经逆行示踪法在面神经损伤修复方面的应用

　　 作者：张丽丽 作者单位：山东大学医学院，济南 250012

　　【摘要】 面神经损伤修复后的形态结构重建和功能恢复非常复杂，相关研究的层面和切入点众多，如面神经的逆行示踪染色、病理学、电生理学检查、免疫组化等。在此，我们概述面神经逆行示踪方法的进展，重点综述其研究方法以及常用的示踪剂种类。

　　【关键词】 面神经 神经损伤 再生修复 逆行示踪

　　面神经损伤修复后通常遗留一系列并发症，如联带运动、鳄鱼泪综合征、镫骨肌收缩、面肌挛缩和半面痉挛等，其发生机制是在面神经再生过程中，因轴索生长方向错误或某些轴索的髓鞘再生障碍、相邻轴突“短路”等导致末梢器官的神经再支配出现紊乱或不完全。神经逆行示踪染色是研究解决此问题的方法之一，现就其原理、实验方法以及常用示踪剂等综述如下。

　　1 原理

　　逆行示踪主要依靠神经纤维的轴浆流将示踪剂从外周神经运输到神经元胞体内。轴浆流作为神经元的一项基本活动，能保持神经元胞体与神经末梢长距离功能联系，运输神经递质、有关酶和其他物质到胞体，是再生神经纤维形态结构和功能恢复的重要活动形式。通过逆行示踪染色，了解再生神经纤维与神经元胞体的联系以及轴浆流的恢复，方法有效。

　　2 确定神经再生的方法

　　2.1 计数标记神经元的个数 神经损伤后其再生轴索可长入支配另一器官的神经内，这种再支配通过神经逆行示踪染色的动物实验证实，即在神经损伤之前，向神经或神经所支配的肌肉内注射一种示踪剂;在神经损伤修复后一定的再生时间后，于损伤处的远侧端注射另一种示踪剂，然后通过计数面神经核内的双标(doublelabeling)神经元的数量，确定是否存在轴索错误再支配以及发生再支配轴索的比例。

　　2.2 观察标记轴索在损伤前后的变化 通过注射两种不同的示踪剂对神经轴索进行染色,观察示踪剂标记的面神经轴索在损伤前后分布的变化，直接确定神经轴索是否存在对末梢器官的错误再支配。

　　3 常用示踪剂及其特点

　　面神经示踪常用的示踪剂大体可以分为三类：辣根过氧化物酶、荧光示踪剂、生物素葡糖聚胺及其他鳌合物。

　　3.1 辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP) HRP法是20世纪70～90年代发展并被广泛应用的一种神经追踪方法，即将HRP注射于神经末梢所在部位，HRP随即被神经末梢通过细胞整体胞饮的方式摄入，逆向运至胞体，然后用组织化学方法显示HRP的运输结果。HRP法的出现促进了神经示踪技术的发展，但由于HRP显影需要许多复杂的免疫组织化学技术，而且HRP参与细胞代谢，不能在细胞内长期存留，易扩散到邻近未进行染色的神经轴索或神经元中造成神经元的误染，其反应产物较不稳定,易丢失。另外还存在“再摄取”现象[12]，故使得HRP在神经逆行示踪方面的应用大大减少。

　　3.2 荧光素示踪剂 上世纪80 年代开始, 荧光染料作神经通路追踪的技术媒介发展起来。它贮存较稳定, 特别是组合采用不同的荧光染料分别标记神经元胞核和胞浆, 可实现荧光双标或多重标记，这是荧光素示踪的一个最大优点。这种示踪剂染色后只需使用荧光显微镜，便可观察到已被标记的神经纤维或胞体。下面介绍几种常用的荧光素。

　　3.2.1 固蓝(fast blue，FB) FB系水溶性染料,其颗粒较细密，易于被神经轴索摄取，所以标记神经纤维或胞体多于其他染料，易于从标记细胞内扩散到周围组织，照射时褪色较快，即使保存在低温、避光条件下，仍不能长期保存。对需要标记后较长时间的观察，或需分离培养神经元细胞进行实验研究则不太理想。

　　3.2.2 荧光金(fluoro gold，FG) FG系脂溶性染料,能标记细胞质，呈金黄色强荧光，而细胞核不着色，能很好显示树突分支，细胞外无荧光染料渗漏，不易扩散，与周围组织分界清晰，褪色比较慢;可以经受许多组织学染色处理，因而可以和HRP、免疫组织化学等方法结合。其在细胞质内的存在不超过3周[3]。Fluororuby(FR)及Fluoroemerald(FE)的特性与FG相似。

　　3.2.3 碳化青(1,1′Dioctadecyl3,3,3′,3′tetramethylindocarbocyanine perchlorate，DiI) DiI是一种紫红色晶体，具有高度的亲脂性,通常用乙醇溶解。它荧光强而稳定,无毒性，不影响被标记细胞的存活、生长，在标记细胞内消失慢、单纯沿脂质膜扩散，有良好的轴突特异性，且对过路纤维影响小[4]。但也存在大多数荧光追踪剂的易于淬灭及易向神经元胞体外扩散的问题。崔建礼等[5]发现注射DiI后14天，相同平面神经干内示踪面积虽无明显扩大,但外膜、束膜内的荧光范围有所扩大,背景荧光增强。

　　3.3 生物素葡糖聚胺(biotindextran amine，BDA) 应用于轴浆运输的各种示踪剂,常用来研究神经元的分支投射,但很少有直接用于直观地观察周围神经局部轴突的运输。而BDA是一种与生物素结合的多聚葡萄糖胺，适宜作为长传导束的示踪剂，在细胞外注射后，可以被神经元及其突起摄取，然后顺行或逆行沿轴突转运至远处，经显影即可显示所标记区域的神经走行，其生物性稳定，具有保存时间长，并可与多种荧光追踪剂及各种免疫组织化学技术相结合的优点[6]，能满足光镜及电镜下观察的要求。相对于HRP与荧光素示踪剂，经处理的BDA标记组织标本可以保存6个月以上，不影响最终显影结果。

　　3.4 其他鳌合物 常见的有麦芽凝集素、霍乱毒素β亚单位与HRP共价偶联后形成麦芽凝集素结合辣根过氧化物酶(wheat germ agglutininhorseradish peroxidase，WGAHRP)、霍乱毒素β亚单位结合辣根过氧化物酶(cholera toxin subunit Bhorseradish peroxidase，CBHRP),霍乱毒素B荧光素鳌合物、霍乱毒素B皂草素、BDA螯合物等。通过细胞膜上的螯合物受体介导被胞饮入神经元胞体，大大提高其作为示踪剂的灵敏度，明显加强其标记程度。

　　4 示踪剂在面神经损伤修复方面的应用

　　4.1 HRP 1982年Watson等[7]最先利用HRP逆行示踪确定了大鼠面神经核的躯体定位，李蜀光等[8]应用重组NTN (Neurtuin) 神经营养因子/PGLA (polygly colactic acid, 聚乙交酯-丙交酯) 导管修复切断的面神经，运用HRP逆行示踪标记面神经核内神经元的部位和数量，发现用NTN/PGLA 导管修复后神经元分布异位明显少于自体神经移植修复, 提示较少发生轴突误向再生, 减少面肌联带运动的发生。

　　由于CBHRP是一种高灵敏度、无毒的神经示踪剂，当它被注入终板区后,立即被突触终未摄取,通过逆行轴突运输到胞体,使用较为广泛。张文捷等[9]通过构建胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line—derived neurotropic factor，GDNF)修饰的神经移植复合体，应用CBHRP神经逆行示踪技术，对这种复合体的运动神经元保护作用进行评价。认为雪旺细胞的转基因处理可能弥补单纯细胞移植神经营养因子含量的不足, 可能达到与自体神经移植相似的效果。另外，张风河等[10]通过在损伤的面神经近中侧注射霍乱毒素进行示踪，对再生神经纤维进行免疫组化染色，发现p75神经营养蛋白受体(p75NTR)基因敲除小鼠再生的神经纤维，明显较野生型小鼠的短，由此得出结论，p75NTR可以增强面神经的再生。

　　4.2 荧光素 陈沛等[11]应用荧光金逆行示踪结合免疫荧光组织化学的双重标记技术，观察了面神经损伤后其神经元周围星形胶质细胞的塑形活动，发现晚期塑形活动很可能与联带等后遗症的产生机制关系密切。

　　采用不同的荧光素有不同的激发波长及发射波长，产生不同颜色的荧光，可以把不同的荧光素注射到神经内作双标或多重标记。通过对FB、FG、FR、FE、DiI进行对比，Choi等[12]发现FB在神经染色中更稳定，若与DiI一起使用注射到神经外膜表面能更好地标记神经轴索。所有这些示踪剂在注射后1周左右可使神经元获得足够的标记，而且除FG外都能持续染色至第8周，表明FG是不适合作长期观察的示踪剂。Romansky等[13]将面神经吻合术和面神经移植术后的颞支和颊支分别注射DiI和FB后，观察3个月，发现神经吻合术后的双标神经元计数多于神经移植术，得出结论面神经端-端吻合术神经修复效果优于面神经移植术。

　　2004年Choi等[14]通过实验，先将对照组正常面神经的分支—颞支进行FB染色，颊支行FR染色，计数面神经核内标记的两种神经元;再将第二组面神经主干颅外段的上半部半切，再用同样的染色方法进行染色和计数神经元。结果显示，第一组FB标记的神经元明显高于第二组，说明颞支的神经纤维大部分走行于颞骨外段面神经干的上部。另外还进行了两组实验，即在面神经修复处的近、远端分别进行半切，然后用FB和FR染色，结果发现两组标记的神经元无明显差别，这意味着神经轴索的错向再生不仅仅在面神经损伤处发生，而且损伤处两侧很长范围内有可能也存在。不过这种现象的产生是由于轴索的杂乱分支再生，还是轴索在神经不同部位定向错误，还需进行更进一步的实验。

　　4.3 其他 实验对象的年龄以及神经损伤处加入一些干扰因素(如神经修复细胞、神经营养因子等)，均可影响神经的修复速度和轴索的再生质量，通过神经的逆行示踪法可以清楚地显示这些干扰因素对神经修复的影响。

　　实验动物的年龄对神经修复再生的影响可以通过Le等[15]的研究看出，他们通过注射双重示踪剂至再生的坐骨神经皮支和肌支，计数标记神经元，结果发现越年轻的动物(大鼠)其受损伤的坐骨神经修复越快，发生轴索错向再支配的比例越小。但由于该实验中供体与受体神经的直径有一定的差异，减少了大龄大鼠的染色神经元，实验结果有一定偏差，而且坐骨神经是否与面神经有同样的结果还需进一步的实验来证实。

　　Choi等[16]将体外培养获得的施万(Schwann cells,SCs)、嗅鞘(olfactory ensheathing cells,OECs)和S型嗅鞘细胞(Stype OECs)移植到面神经损伤处，通过注射两种不同的示踪剂至面神经颞支和颊支，计数逆行标记的神经元数量及观察面肌功能恢复程度，从而确定面神经的修复情况。发现OEC和S型OEC组的双标神经元要多于对照组和SC组，所有实验组的神经元总数并不比对照组多，说明这些细胞的移植并不能促进神经元的再生，但在这些细胞的诱导之下，轴索能更好地沿直线生长至原来支配的器官，而不是错乱生长。由于移植细胞时，不可避免地将用于培养细胞的培养基及神经营养因子一并移植至面神经损伤处，使面神经周围整个微环境发生改变，有可能同时也促进了面神经的修复。是否有多种因素共同作用于受损地面神经，使面神经发生轴索错向再生和面神经核的躯体定位的重构，需要进一步探讨。

　　综上所述，现在较常用的各种示踪剂各有特点，辣根过氧化物酶最早应用于神经的逆行示踪，但由于使用方法较复杂且稳定性差、易扩散，限制了它的应用;荧光示踪剂使用方法简便易行、易观察，但存在荧光的淬灭现象，仅适用于短期观察，而生物素葡聚糖胺则不存在这种现象，其结果可以保存较长时间。其他毒素或病毒鳌合物能良好地显示神经元链或网络，但在面神经的逆行示踪方面应用较少。这提示我们，在今后的实验中应该针对不同的实验目的,选用合适的示踪剂以获得预期的实验结果。

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