老年膀胱癌细胞中心体异常与p53蛋白表达的关系及意义

　　作者：王连渠,王明,谭毅　　作者单位：重庆医科大学附属第一医院泌尿外科，重庆 400016

　　【摘要】目的研究膀胱移行细胞癌细胞中心体异常情况与p53蛋白表达的关系及临床意义。方法 采用免疫组化方法，对76例膀胱移行细胞癌标本进行中心体异常和p53蛋白表达的检测。结果 在76例膀胱移行细胞癌中，中心体异常阳性56.6%(43/76)和p53阳性蛋白表达63.2%(48/76)。都与肿瘤的病理分级、临床分期、肿瘤数目、有无复发及疾病进展有关(P<0.05);且两者之间呈正相关(r=0.7067，P<0.01)。结论 膀胱癌细胞中心体异常与p53基因突变有关，研究二者的关系有助于加深理解肿瘤发生机制，为临床寻找新的治疗方法提供基础。

　　【关键词】 中心体异常;染色体不稳(CIN);p53;膀胱移行细胞癌

　　膀胱癌在我国是泌尿外科最常见的恶性肿瘤，在男性占全部癌的3.1%，女性占全部癌的1.6%，其中尿路上皮肿瘤占97%以上;在尿路上皮肿瘤中，移行细胞癌占其中的90.4%。其发病率与年龄有密切关系;在40岁以下发病较少，且预后良好，60岁以后发病率逐渐增高，其生物学行为特性是容易复发，其中部分复发病例出现疾病进展〔1〕。因而在临床上寻找一种切实有效的预后指标和新的治疗方法尤为重要。本研究通过对膀胱移行细胞癌细胞中心体异常与p53蛋白表达及二者的关系的研究，以探讨其临床意义。

　　1 材料和方法

　　1.1 标本的收集和选取 本院2004年1月～2007年6月切除的膀胱移行细胞癌标本中选取76例老年患者进行中心体特性与p53蛋白表达的研究，同时选取其中5例标本的正常膀胱黏膜上皮作为正常对照。男42例，女34例，年龄50～86(平均66.8)岁;其中按病理分级，G116例，G239例，G321例;按临床分期，无侵犯肌层(Tis1)57例，侵犯肌层(T24)19例;其中单发肿瘤42例，多发34例;所有病例随诊6～30(平均22.8)个月，其中发现肿瘤复发39例，有疾病进展23例。本组病例均经过本校病理教研室专家组复核无误。外科手术切除的膀胱移行细胞癌标本，用10%甲醛液固定，常规石蜡包埋。

　　1.2 主要试剂和染色方法 第一抗体单克隆鼠抗人γ微管蛋白抗体(GTU88)(美国Sigma公司产品)，第一抗体单克隆鼠抗人p53抗体，第二抗体FITC标记山羊抗鼠IgG，SP9002免疫组化染色试剂盒，碘化丙啶 (PI)，DAB显色试剂盒，封闭用正常山羊血清工作液，包被玻片用多聚赖氨酸(均为北京中杉金桥生物试剂公司产品)。中心体染色采用间接免疫荧光染色方法。p53蛋白染色采用SP三步法。具体步骤按说明书进行。每一批染色同时从研究标本中随机抽取2～4张切片，以PBS代替一抗的同步染色作为阴性对照。

　　1.3 结果判定 中心体异常的计算：把具有以下特征之一的中心体判断为异常中心体：①一个细胞内观察到3个或者多个中心体;②中心体的直径大于作为阴性对照的正常膀胱黏膜上皮细胞的中心体直径2倍及以上甚至出现巨块状中心体;③中心体形状异常，成长条形或线状。每一切片观察不少于100个细胞。组织切片中肿瘤细胞中心体异常数目<5%记为阴性(CH-)，≥5%为阳性(CH+)〔2〕。p53蛋白的阳性表达判定：p53阳性表达显示在组织切片细胞中细胞核出现棕黄色颗粒为阳性，根据抗体在切片中阳性反应细胞的比例分为：阳性细胞数<10%或完全消失的标记为()，阳性细胞数10%～90%标记为(+);阳性细胞数>90%标记为()。阳性细胞数的计算标准：观察500个肿瘤细胞。阳性细胞数/500×100%来计算〔3〕。

　　1.4 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行配对χ2检验或Fisher分析。

　　2 结 果

　　中心体γ-微管蛋白表达于

　　细胞核，呈绿色荧光(SP，×200)2.1 p53蛋白表达阳性结果 在76例膀胱移行细胞癌标本中，中心体异常阴性(CH-)33例 (43.4%)，阳性 (CH+) 43例(56.6%)，p53蛋白表达分别为：(-)28例(36.8%)，中心体异常阳性3例;(+)14例(18.4%)，()34例(44.8%)，中心体异常阳性为40例。中心体异常阳性，p53蛋白表达阳性。

　　p53阳性表达于细胞核，呈棕黄色颗粒(SP，×200)

　　2.2 p53表达阳性折临床参数 在76例膀胱移行细胞癌中，不同病理分级，临床分期，肿瘤数目(单发与多发)，疾病是否进展及有无复发之间，(CH+)和p53阳性表达都有显著差异(P<0.05，P<0.01)。(CH+)和p53阳性表达与膀胱移行细胞癌其他参数之间关系。

　　2.3 p53阳性表达的相关性分析 在76例膀胱移行细胞癌中，(CH+)和p53阳性表达结果之间差异不显著(P>0.05)，但两者之间存在显著相关性(r=0.706 7，P<0.01)。 膀胱移行癌细胞中心体异常阳性和 p53阳性与临床参数间的关系

　　3 讨 论

　　中心体是细胞内一种微小非膜型细胞器，由一对互相垂直的短筒状中心粒(centrioles)和中心粒周围物质(pericentriolar material, PCM)组成。它的功能是在间期及有丝分裂期的细胞中作为主要的微管组织中心。在有丝分裂过程中它建立两级纺锤体，纺锤体的微管牵引染色体向两级运动，从而确保复制后的染色体分配到两个子细胞中去，以维持基因组的稳定〔4〕。中心体结构和功能异常至少有两个功能性的后果可能在肿瘤发生、发展中起着重要作用：第一，中心体复制异常形成的多中心体可能导致细胞极性改变、细胞及组织的分化异常;第二，中心体异常导致的有丝分裂纺锤体缺陷，可能导致染色体分离错误，中心体的过度复制会形成多极纺锤体，后者使复制后的两套染色体分配到两个以上的子细胞中去。而且多极纺锤体施加在单个染色体上的多方向的力会引起染色体断裂;中心体复制或分裂失败形成单极纺锤体。从而引起染色体不分离，在上述情况下，子细胞都会得到异常数目的染色体而形成非整倍体，即CIN表型〔5〕。因此中心体的异常与肿瘤基因非整倍体的发生可能存在直接机制上的联系。Boveri首先提出恶性肿瘤极性的改变和染色体分离异常(非整倍体)，可能是由于中心体功能异常而引起。之后许多学者分别在不同的恶性肿瘤中，观察到中心体结构的异常。

　　Kawamura〔6〕和Yamamoto〔7〕等在对膀胱移行细胞癌细胞中心体结构的研究中显示：在切除的临床标本中膀胱癌细胞中心体异常扩增发生率明显高于癌旁组织细胞，且中心体异常扩增发生率与膀胱癌临床分期及病理分级有关，预示中心体异常扩增影响膀胱癌的发生及浸润进展;中心体异常扩增和非扩增病例间在肿瘤数目、病理级别、复发率、疾病进展率、20q13异常、CIN、染色体碎片数目、DNA倍性各方面都存在显著差异，多变量分析提示中心体异常扩增是非肌肉侵犯膀胱癌最可靠的预后参考指标。本组实验的研究结果提示中心体异常与膀胱移行细胞癌的恶性程度有关，检测中心体异常阳性可作为膀胱癌预后的一个指标。

　　p53基因是1个抑癌基因，编码野生型p53蛋白。野生型p53蛋白的半衰期为6～20 min，用一般的免疫组织化学方法难以检测到，当其突变后编码的突变型p53蛋白的半衰期为6 h，用免疫组织化学方法可检测到，即用免疫组织化学方法可间接检测到p53基因的突变。本组实验的研究结果表明p53表达反映了膀胱癌恶性程度高，具有侵袭性和转移倾向;p53可能是判断膀胱癌预后的重要指标〔3〕。

　　p53蛋白有多种功能，参与多个细胞周期调控事件，也与中心体复制调控有关。p53的突变失活能在一轮细胞周期中触发多轮中心体复制。这说明p53通过多个作用途径调控中心体复制循环。这些作用途径的具体机制还有待研究，目前猜测可能是通过p53的转激活-非依赖性和转激活-依赖性机制完成的〔8〕。前者可能是通过影响中心体上的激酶STK15/BTAK完成。后者是通过cyclin ECDK2复合体使中心体扩增失调。本实验通过对膀胱移行细胞癌中心体异常与膀胱癌的p53基因突变的发生率关系的统计学分析证实：膀胱移行细胞癌中心体异常阳性与p53阳性表达都可作为肿瘤预后的一个指标，两者存在显著一致性，无明显差异(P>0.05)。而且两者具有显著相关性(P<0.01)。这与Kawamura〔9，10〕等研究结果相一致。说明膀胱移行细胞癌中心体异常阳性与p53基因突变有关。

　　总之，临床联合运用临床分期及病理分级并检测中心体异常阳性和p53蛋白阳性表达有助于更加准确判断膀胱移行细胞癌的预后，为临床上每位老年患者制定个性化治疗方案提供理论上的依据，同时中心体亦可以作为恶性肿瘤的化学治疗和基因的一个新靶点，从而为临床上提供新的治疗方法。

　　【参考文献】

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　　2 Yamamoto Y, Matsuyama H, Furuya T, et al. Centrosome hyperamplification predicts progression and tumor recurrence in bladder Cancer〔J〕. Clin Cancer Res，2004;10(19):644955.

　　3 史忠新，贺 颖，王彩芹.胃癌组织β连接素和p53的表达与临床病理参数的关系〔J〕.中国老年学杂志,2007;27(8):1499500.

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　　6 Kawamura K, Moriyama M, Shiba N, et al. Centrosome hyperamplification and chromosomal instability in bladder cancer〔J〕.Eur Urol, 2003;43(5):50515.

　　7 Yamamoto Y, Matsuyama H, Chochi Y, et al. Overexpression of BUBR1 is associated with chromosomal instability in bladder cancer〔J〕.Cancer Genet Cytogenet, 2007;174(1):427.

　　8 Kramer A，Neben K，Ho AD.Centrosome replication， genomic instability and cancer〔J〕.Leukemia，2002;16(5):76775.

　　9 Kawamura K, Moriyama M, Suga K, et al. Centrosome isolation from cultured bladder cancer cellsp53 mutation and centrosome hyperamplification〔J〕. Hinyokika Kiko，2003;49(2):6974.

　　10 Kawamura K, Izumi H, Ma Z, et al. Induction of centrosome amplification and chromosome instability in human bladder cancer cells by p53 mutation and cyclin E overexpression〔J〕. Cancer Res, 2004;64(14):48009.