HIWI基因在膀胱移行细胞癌细胞株中的表达

　　作者：陈岐辉,卢绩,姜凤明,王春喜　　作者单位：吉林大学第一医院泌尿外科，吉林 长春 130021

　　【摘要】目的 研究HIWI基因在膀胱移行细胞癌细胞株T24、EJ、MGHU1、BIU87中的表达。方法 应用RTPCR和Western blot方法对HIWI基因在膀胱癌细胞株中的表达情况进行检测。结果 HIWI mRNA在膀胱癌细胞株T24、BIU87细胞株中有表达;HIWI蛋白在膀胱癌细胞株T24、BIU87细胞株中有表达，而在EJ、MGHU1膀胱癌细胞株中没有表达。结论 HIWI可能成为膀胱癌一个潜在的基因治疗靶点，可为基因治疗靶点的体外实验研究提供实验基础。

　　【关键词】 HIWI基因;膀胱癌;RTPCR;Western blot

　　Piwi基因是一种在干细胞分裂中具有重要调控作用的基因，HIWI为其在人类组织中的同源物之一。近来的研究表明，HIWI基因可能参与了干细胞增殖，并且其过表达可能引起干细胞的恶性进展，同时在多种肿瘤中也发现有HIWI的过度表达〔1～3〕，目前关于HIWI基因在膀胱癌细胞株中的表达尚未见报道。本文采用RTPCR、Western印迹法对膀胱移行细胞癌细胞株中HIWI基因的表达情况进行研究。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　人膀胱癌细胞株T24、EJ、MGHU1、BIU87购于北京大学泌尿外科研究所，1640培养基、胎牛血清购自美国GIBCO公司，PCR引物、核苷酸混合物、DNA Marker购自大连宝生物公司，Trizol购自上海生工生物工程公司，逆转录酶购自TOYOBO公司，山羊抗人HIWI抗体购自美国Santa Cruz公司，小鼠抗人GAPDH抗体购自北京博奥森公司，辣根酶标记兔抗山羊抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司，辣根酶标记山羊抗小鼠抗体购自北京鼎国生物技术有限公司，SDSPAGE凝胶配制试剂盒、SDSPAGE蛋白上样缓冲液及预染蛋白质分子量标准购自碧云天生物技术研究所，蛋白浓度测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养

　　常规配制培养液，分装血清。T24、EJ、MGHU1、BIU87采用含10%胎牛血清的RMPI1640培养基，于37℃、5%CO2的培养箱内培养。细胞复苏次日后及每隔2 d更换培养液，待细胞长至80%或接近完全融合成片时进行传代。

　　1.2.2 RTPCR

　　0.25%胰蛋白酶消化细胞，培养液洗1次，1 200 r/min离心5 min，收集细胞沉淀，采用Trizol试剂提取细胞总RNA。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定采用紫外分光光度计测定纯度并定量。逆转录反应结束后进行RTPCR，循环参数为95℃5 min，94℃45 s，52℃1 min，72℃1 min，72℃延伸10 min，共30个循环。反应结束后将产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像系统下拍照并分析条带的积分光密度值(IOD)值。HIWI 基因(Genbank accession no.AF104260)引物参照文献〔4〕设计，通过BLAST查询，与其他已知基因无同源性。GAPDH基因(Genbank accession no.NM_002046)引物参照文献〔5〕设计，与已知的17种GAPDH假基因有较低的同源性。引物序列由大连宝生物公司合成，序列具体如下：HIWI上游：5′ACGCTGCATATTTCAGGATAGA3′，下游：5′GACAGTGACAGATTTGGCTCTC3′，扩增片断长度为585 bp;GAPDH上游：5′AGCCACATCGCTCAGACAC3′，下游：5′GAGGCATTGCTGATGATCTTG3′，扩增片断长度为472 bp。

　　1.2.3 细胞总蛋白的提取

　　倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上，使吸水纸吸干培养液;每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS，平放轻轻摇动1 min洗涤细胞，然后弃去洗液，重复操作两次;再向瓶中加入1ml PBS，用细胞刮将细胞刮下，转移细胞悬液至EP管中，4℃12 000 r/min离心5 min，弃上清;将EP管置于冰上，向其中加入100～200 μl单去污剂裂解液(含终浓度1mmol/L PMSF)，悬起细胞;冰上裂解30 min;4℃12 000 r/min离心5 min;将离心后的上清分装25～50 μl/管，-20℃保存。采用考马斯亮兰法测定蛋白质浓度。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：配置分离胶及浓缩胶，每孔上样50 μg蛋白，电压80 V开始电泳，观察溴酚兰到分离胶后将电压提高到120 V，继续电泳，待溴酚兰到达凝胶底部时停止电泳。Western印迹：200 mA恒流转膜90 min;根据分子量大小裁剪硝酸纤维膜，封闭液浸泡过夜;将一抗用TBST溶液稀释至适当浓度(HIWI 1∶200)，37℃抗体孵育1 h;同样方法加入二抗反应液37℃孵育1 h，TBST洗膜。化学发光、显影、定影。将X光片扫描，用凝胶系统分析目的蛋白及内参蛋白IOD值。

　　2 结果

　　2.1 HIWI mRNA在膀胱癌细胞株T24、EJ、MGHU1、BIU87中的表达

　　HIWI mRNA在T24、BIU87细胞株中有表达，在EJ、MGHU1则不表达。HIWI及GAPDH mRNA条带的IOD值，在T24、BIU87中HIWI mRNA的表达量基本相当。

　　2.2 HIWI蛋白在膀胱癌细胞株T24、EJ、MGHU1、BIU87中的表达

　　HIWI 蛋白在T24、BIU87细胞株中有表达，在EJ、MGHU1则不表达。

　　3 讨 论

　　Piwi基因是Lin首先在果蝇的生殖干细胞内发现的〔6〕，Piwi基因家族在进化中具有高度的保守性，在线虫、鼠、拟南芥等其他动物和植物中都发现有其同源物，在干细胞的自我更新、配子形成、RNA干扰以及翻译调节中具有重要作用。代表piwi人类同源物的部分cDNA首先从人类睾丸cDNA文库中筛查出来，命名为hiwi〔7〕，定位于人类12号染色体长臂〔8〕。

　　Sharma等〔8〕发现Hiwi基因在人CD34+造血干细胞中也有表达，并广泛分布在胚胎和成人的肾中。但Sasaki等〔4〕通过PCR反应分析多种人类组织发现，包括HIWI基因在内的Piwi家族四个成员主要在睾丸组织中表达，而在其余正常成人及胎儿的器官组织中均未见表达。由于其家族基因HIWI在干细胞维持和种系发展中的保守作用，人们对HIWI基因在干细胞原性肿瘤中的作用首先展开了研究，在青少年和成人的睾丸生殖细胞肿瘤及老年人的精母细胞的精原细胞瘤中都检测到了HIWI表达〔3〕。本文应用RTPCR和Western blot方法对HIWI基因在T24、EJ、MGHU1、BIU87中的表达情况进行检测发现，在T24和BIU87膀胱癌细胞株中有HIWI基因表达。Liu 等〔2〕就HIWI基因在人类胃癌中的表达及其可能的作用机制进行了研究，发现在几种不同的胃癌细胞株中都有HIWI基因表达，标本中的表达率随着恶性度的增加而逐渐增加，并且通过反义寡核苷酸或RNA干扰方式抑制HIWI的表达后，抑制了胃癌细胞的生长并诱导细胞周期停滞在G2/M期。因此，认为HIWI基因参与了胃癌的进展过程，并可以作为肿瘤治疗的潜在靶点。推测HIWI基因可能参与了干细胞分化及增殖，当过度表达时导致了细胞分化的紊乱，引起干细胞的恶性进展，并导致肿瘤发生。

　　综上，本文认为HIWI基因可能在膀胱癌的发生及进展中起重要作用，有待于进一步对膀胱癌组织中HIWI基因表达情况进行检测证实，并可以此为基础以HIWI基因作为膀胱癌潜在基因治疗靶点进行体外实验研究。

　　【参考文献】

　　1 Taubert H，Greither T，Kaushal D，et al.Expression of the stem cell selfrenewal gene Hiwi and risk of tumourrelated death in patients with softtissue sarcoma〔J〕.Oncogene，2007;26:1098100.

　　2 Liu X，Sun Y，Guo J，et al.Expression of hiwi gene in human gastric cancer was associated with proliferation of cancer cells〔J〕.Int J Cancer，2005;118：19229.

　　3 Qiao D，Zeeman AM，Deng W，et al.Molecular characterization of hiwi，a human member of the piwi gene family whose overexpression is correlated to seminomas〔J〕.Oncogene，2002;21:398899.

　　4 Sasaki T，Shiohama A，Minoshima S，et al.Identification of eight members of the Argonaute family in the human genome small star，filled〔J〕.Genomics，2003;82:32330.

　　5 Thomas J，Wang L，Clark RE，et al.Active transport of imatinib into and out of cells：implications for drug resistance〔J〕.Blood，2004;104:373945.

　　6 Lin H，Spradling AC.A novel group of pumilio mutations affects the asymmetric division of germline stem cells in the Drosophila ovary〔J〕.Development，1997;124:246376.

　　7 Cox DN，Chao A，Baker J，et al.A novel class of evolutionarily conserved genes defined by piwi are essential for stem cell selfrenewal〔J〕.Genes Dev，1998;12:371527.

　　8 Sharma AK，Nelson MC，Brandt JE，et al.Human CD34(+) stem cells express the hiwi gene，a human homologue of the Drosophila gene piwi〔J〕.Blood，2001;97:42634.