绞谷蓝皂苷含药血清对谷氨酸氧化性神经损伤的保护作用
发表时间:2011-06-21 浏览次数:304次
作者:刘鲁华,逯素梅,孙涛,张道来,冯玉新,辛华 作者单位:山东大学医学院细胞生物学研究所, 山东 济南 250012
【摘要】 目的 研究绞股蓝皂苷(gypenosides,GP)含药血清对谷氨酸(glutamic acid ,Glu)诱导的氧化性神经损伤的保护作用。方法 采用中药血清药理学方法,收集GP含药血清,以体外培养的胎鼠大脑皮层神经元为研究对象,采用倒置相差显微镜观察细胞形态;MTT法测定细胞存活率;Ho33342/PI荧光双染法鉴定细胞死亡方式;生化法检测细胞内超氧化物歧化酶(Super Oxide Dismutase,SOD)活性和谷胱甘肽(LGlutathione,GSH)含量;流式细胞仪测细胞内游离Ca2+变化,综合评价GP含药血清对谷氨酸氧化性神经损伤的保护作用。结果 谷氨酸可导致神经细胞发生凋亡和坏死;GP含药血清能明显拮抗谷氨酸的细胞损伤作用,提高细胞的存活率,维持细胞内较高GSH含量和SOD活性,抑制细胞内游离Ca2+浓度的升高。结论 GP含药血清能明显拮抗Glu诱导的氧化性神经毒性,以400?mg· kg-1·d-1GP灌胃含药血清作用最显著。
【关键词】 绞股蓝皂苷;含药血清;谷氨酸;氧化神经毒性;原代培养神经细胞
AProtective effect of gypenosidescontaining serum against oxidationneurotoxicity induced by glutamate
LIU Luhua, LU Sumei, SUN Tao, ZHANG Daolai, FENG Yuxin, XIN Hua
Institute of Cell Biology, School of Medicine, Shandong University, Jinan 250012, China
To investigate the neuroprotective effects of gypenosides (GP) containing serum on glutamate (Glu) induced oxidation toxicity to cortical neurons. Methods Sera containing GP was collected by way of seropharmacology, and the primary cortical neurons isolated from Wistar rats E1415d embryos were studied. The viability of cells was detected by the MTT method, the cellular death pathway was analyzed by Ho33342 and the PI doublelabeled method, the contents of SOD and GSH were determined by a biochemistry method, and Cytosolic [Ca2+] was determined by flow cytometry (FCM). Results Compared with Glu, GPcontaining serum could increase the cell survival rate and block the decrease of SOD and GSH and the increase of cytosolic[Ca2+]. Conclusions GPcontaining serum can protect the neurons from damage of glutamate oxidative neurotoxicity and the 400?mg/kg/d GPcontaining serum has the strongest antagonistic action.
Key words: Gypenosides containing serum; Glutamate; Oxidative neurotoxicity; Primary cultured neurons
体内转化后的含药血清对谷氨酸氧化性神经损伤的保护作用,为深入研究GP在体内的神经保护作用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
Wistar雌雄大鼠,体重(200±10)g,清洁级;14~15?d Wistar孕大鼠,均由山东大学实验动物中心提供。
1.1.2 主要试剂
GP(纯度>98%)为陕西安康制药厂产品;MTT、荧光染料Ho33342、碘化丙碇(peronide iodine,PI) 、LGlutamate、LPolylysine为美国Sigma公司产品;胰蛋白酶、DMEM、胎牛血清为Gibco公司产品;Fluo3/AM为美国invitrogen公司产品;GSH、SOD测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
1.1.3 主要仪器
倒置荧光显微镜购自日本Nikon公司;超声细胞破碎仪购自宁波新芝生物科技股份有限公司;Multiskan MK3酶标仪购自芬兰Labsystems公司;722光栅分光光度计购自上海制造厂;FACScan型流式细胞检测仪购自美国BD公司。
1.2 方法
1.2.1 大鼠含药血清制备
Wistar大鼠共42只,饲养一周适应环境。实验前称重,随机分组(每组各6只,雌雄各半),分为GP灌胃组(设6个浓度:50、100、200、300、400、1000?mg· kg-1·d-1GP灌胃)和空白对照组(灌胃三蒸水)。每天灌胃量分2次给与,连续3?d。灌胃体积均1?mL,正常饮食。第3?d晚上禁食不禁水,次日早上一次性灌胃1?d量。灌胃后1~2?h内,心脏取血,分离血清。经56?℃、30?min灭活处理后,用0.22?μm孔径的无菌滤器除菌。分装,于-20?℃冰箱中保存备用。
1.2.2 胎鼠大脑皮层神经元培养
受孕14~15?d的Wistar大鼠,脱臼处死。无菌条件下取出胚胎,分离出大脑皮层,去脑膜,0.125%胰蛋白酶消化制备细胞悬液。以40×105/mL的细胞密度接种于涂有0.1% LPolylysine的96孔板(100?μL /孔)、24孔板或25?cm2培养瓶中,于37?℃、5%CO2饱和湿度条件下培养。细胞培养液为含10%胎牛血清和0.1?mg/mL L谷氨酰胺的DMEM溶液。
1.2.3 细胞实验分组
实验分三组:①正常对照组;②Glu损伤组;③GP含药血清保护组。细胞接种培养24?h时,①、②组加入蒸馏水灌胃组大鼠血清,③组加入GP含药血清,终浓度均为5%, MTT法中第③组分别加入6种不同浓度的GP含药血清,每组设6个复孔。其余检测方法中第③组只加入400?mg·kg-1·d-1 GP灌胃含药血清。继续培养12?h后,②、③组再加入Glu(2?mmol·L-1 12?h)。
1.2.4 形态学观察
定时在倒置相差显微镜下观察培养细胞的生长情况,并适时记录各组细胞形态学变化。
1.2.5 MTT法检测细胞存活率
细胞接种在96孔板中,分4组:正常对照组、Glu损伤组、GP含药血清保护组和空白组,前三组分组方式见方法1.2.3;空白组只加培养液和蒸馏水灌胃组大鼠血清(终浓度5%),不接种细胞。Glu作用8?h时各组同时加入20?μL MTT(5?mg/mL),4?h后吸出孔中所有液体,每孔加入100?μL二甲基亚砜,振荡待颗粒全部溶解后,用全自动酶标仪测定各孔光密度(OD值)(测试波长570?nm,参考波长630?nm)。各平行孔取均值后,按下式计算细胞相对存活率:细胞相对存活率%=(OD实验组-OD空白组)/(OD正常对照组-OD空白组)×100%。
1.2.6 Ho33342和PI荧光双染法鉴定细胞死亡方式
细胞接种在放有盖玻片的24孔板中,细胞分组见方法1.2.3。Glu作用12?h后,将长满神经细胞的盖玻片取出,PBS洗细胞3次,加入Ho33342(10?μg/mL)和PI(50?μg/mL)荧光染液,37?℃避光温育30?min,再用PBS轻洗6次,在荧光显微镜紫外光激发下观察。
1.2.7 SOD活性和GSH含量检测
细胞分组见方法1.2.3。Glu作用终止后,收集各组细胞(106个):PBS洗后悬浮,冰浴条件下超声波破碎(振幅14?μm,超声处理3~5次,每次8?s),12?000?r/min离心60?min,取上清,依试剂盒说明书进行各步反应。考马斯亮兰标定各组蛋白含量。
1.2.8 细胞内游离Ca2+的测定
实验分4组:正常对照组、Glu损伤组、GP含药血清保护组和空白组,前三组分组见方法1.2.3;空白组只接种细胞;Glu作用12?h后,取5×105个的细胞,加入荧光探针Fluo3/AM,终浓度10?μmol/L(空白组不加作为阴性对照),37?℃避光孵育1?h,PBS洗3遍后,流式细胞仪检测,激发波长506?nm,发射波长526?nm,随机测定单个神经元的荧光强度值,取10?000个神经元荧光强度值的平均值为各组测定值。
1.3 统计学处理
实验数据以±s表示,统计学处理采用SPSS10.0软件进行。不同组别的比较采用两样本的t或u检验进行分析,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 形态学观察
见图1。图1A为培养48h的正常组细胞,细胞之间建立突起联系,胞体饱满,折光度好。图1B为Glu损伤组细胞,大部分细胞突起回缩、变短,可见大量碎片,细胞变成圆形,立体感和折光度降低,黏附力下降,部分细胞开始脱壁。图1C为GP含药血清保护组细胞生长状态良好,胞体饱满,立体感强,细胞间突起联系广泛,少见皱缩细胞,状态接近于正常对照组细胞。
2.2 MTT法检测细胞存活率
见表1。由表1可见,Glu损伤12?h后,Glu损伤组细胞仅保持约34.48%的相对存活率;GP含药血清保护组细胞可维持较高的存活率,以400?mg·kg-1·d-1 GP灌胃组含药血清保护组的细胞存活率最高(89.84%),保护作用最明显。各组间的比较采用两样本的t检验,差异有统计学意义(P<0.05)。
2.3 Ho33342和PI荧光双染观察细胞死亡方式
见图2。图2B为Glu 损伤组细胞,部分细胞呈现蓝色荧光,为膜功能正常细胞,其中部分细胞核变形,呈凋亡状态;部分细胞呈现红色荧光,为膜功能受损的坏死细胞。图2C为GP含药血清保护组细胞,呈蓝色荧光的细胞明显增多,少见凋亡和坏死,与图2A中正常组细胞形态接近。表1 MTT法检测细胞存活率(略)
2.4 SOD活性和GSH含量检测
见表2。由表2可见,400?mg·kg-1·d-1灌胃组GP含药血清能维持细胞内GSH于较高水平(1?063.932?mg/L)而不被耗竭,明显高于Glu损伤组(523.458?mg/L),低于正常组(1?443.208?mg/L);GP含药血清能提高细胞内SOD酶活性(279.99?U/mg),明显高于Glu损伤组(157.76?U/mg),与正常组的酶活性(468.66?U/mg)较接近。各组间比较采用两样本的t检验,差异有统计学意义(P<0.05)。表2 SOD活性和GSH含量检测(略)
2.5 细胞内游离Ca2+的测定
见表3。由表3可见,与谷氨酸组Ca2+荧光强度值(186.79)相比,400?mg·kg-1·d-1灌胃组GP含药血清的荧光强度值(171.14)明显降低,但比正常组(161.24)高,各组间比较采用两样本的u检验,差异有统计学意义(P<0.05)。表3 游离Ca2+的测定(略)
3 讨 论
Ratan等[8]研究发现,体外培养72?h内的神经细胞膜上Glu离子型和亲代谢型受体尚未发育,Glu主要通过抑制谷氨酸/胱氨酸转运体使胱氨酸入胞减少,从而降低细胞内氧自由基清除剂GSH的生成,使氧化成分堆积产生氧化性毒性。本实验体外培养的神经元取材于14~15?d的胎鼠大脑皮层,早期原代培养48?h, Glu受体尚未发育,因此Glu主要通过氧化性途径对其产生毒性作用。
体外实验证实,GP对谷氨酸氧化神经损伤有明显的保护作用,但药物在体内要经过一系列代谢转化,药效可能发生变化,因此体外实验不能等同于体内实验。本实验的GP含药血清是依据药物在体内代谢的半衰期和达峰时间[910]规律获得,能较好地反映GP在体内的真实药理效应,更接近体内试验。另外,为了避免大鼠血清本身含有的一些活性物质对细胞的影响,本实验采用56?℃、30?min灭活血清并在正常对照组和Glu损伤组细胞中加入空白大鼠血清排除这些影响,使实验结果更具参考意义。
本实验通过MTT法检测细胞存活率,结果表明:Glu显著降低细胞的存活率(34.48%),GP含药血清能明显提高细胞存活率,拮抗谷氨酸的氧化性神经毒性,以400?mg·kg-1·d-1GP灌胃含药血清保护作用最为显著(存活率89.84%)。
Ho33342和PI双染法是根据膜的完整性和染色质凝集程度不同来区别正常、坏死和凋亡细胞。Ho33342可进入膜功能完整的正常和凋亡细胞显蓝色荧光,而凋亡细胞核有染色质凝集、边集或新月形改变;PI只可进入膜功能受损的坏死细胞显红色荧光。本实验双染结果表明,Glu诱导的氧化性神经毒性可引发细胞发生凋亡和坏死两种死亡方式,预先加入GP含药血清能显著拮抗Glu诱导的氧化性神经毒性,降低细胞死亡率。
GSH是体内重要的还原剂,可以在转化为氧化型谷胱甘肽(GSSG)的过程中起到清除活性氧自由基的作用。SOD可催化超氧负离子氧化还原生成H2O2和O2,也是一种重要的氧自由基清除剂。故GSH的耗竭和SOD活性的降低导致细胞内活性氧自由基增加,引起脂质、蛋白质氧化变性及DNA损伤,从而导致神经细胞损伤。本实验结果证明GP含药血清能明显提高细胞内GSH的含量和SOD活性,从而发挥抗Glu氧化性神经毒性作用。
Fluo3/Am为高度特异性的Ca2+荧光指示剂,进人细胞后经非特异性酯酶脱去Am酯,成为水溶的Fluo3留在细胞胞浆内。与胞浆内游离Ca2+结合后,其荧光强度是Fluo3本身的40倍以上,敏感性高,用506?nm波长激发时,其荧光强度与游离Ca2+浓度成正比,可以灵敏地反映细胞内游离Ca2+浓度的变化。Li等[11]研究发现,Glu耗竭GSH后可经过一系列途径引起细胞内游离Ca2超载,进一步激活一系列依赖于Ca2+的信号传递途径,导致细胞损伤。本实验结果表明,GP含药血清可降低Glu导致的细胞内游离Ca2+的升高从而拮抗Glu的这一毒性作用。
综上所述:GP含药血清可以通过提高神经细胞内还原型GSH含量和SOD活性以及降低细胞内游离Ca2+拮抗谷氨酸介导的氧化性神经毒性,以400?mg·kg-1·d-1GP灌胃含药血清的保护作用最为显著。本实验首次报道了绞股蓝皂苷含药血清在体外对谷氨酸诱导的氧化神经细胞损伤的保护作用,为深入研究绞股蓝皂苷在动物体内抗氧化性神经损伤作用提供了实验依据。
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