E-cad在膀胱癌中的表达及意义

　　作者：张东东1,梁衍锋1,罗振国2　　作者单位：1.佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007;2.佳木斯大学附属第一医院，黑龙江佳木斯 154003

　【摘要】目的：探讨E-cad在膀胱癌中的表达及意义。方法：通过免疫组织化学法和RT-PCR法检测E-cad在膀胱癌和正常膀胱组织中的表达。结果：免疫组织化学方法对正常膀胱组织和膀胱癌组织中的E-cad进行了检测，发现E-cad蛋白在膀胱癌组织中的阳性表达率为32.39%(23/71)，正常膀胱黏膜组织表达的阳性率为100%，E-cad在膀胱癌组织中的表达明显低于正常组织。RT-PCR法从基因水平检测正常膀胱组织和膀胱癌组织中E-cad的表达，E-cad在正常膀胱组织所得光密度值为0.940±0.052，膀胱癌组织的光密度值为0.754±0.044，经统计学分析，E-cad在膀胱癌组织中的表达与正常膀胱组织表达相比差异有显著性(t=11.142，P<0.01)。结论：无论是在蛋白还是基因水平上，E-cad在膀胱癌组织中的表达低于正常膀胱组织的表达。

　　【关键词】 E-cad;膀胱癌;组织;免疫组化;RT-PCR

　　Abstract:Objective： To investigate the expression and significance of E-cadherinin urinary bladder cancer. Methods： The E-cadherin expression was detected by immunohistochemistry and RT- PCR in the normal urinary bladder tissue and urinary bladder cancer tissue. Results： Immunechistochemistry (SABC) method　　showed the positive rate of the E-cadherin expression was 32.39%(23/71) in urinary bladder cancer and 100% in the normal urinary bladder tissue. The E-cadher expression inurinary bladder cancer tissue was significantly lower than that in the normal urinary bladder tissue. RT- PCR method showed the optical density value of E-cadherin was 0.940±0.052 in the normal urinary bladder tissue and that was 0.754±0.044 in the urinary bladder cancer tissue. The E-cadherin expression in the urinary bladder cancer tissue was significantly lower than that in the normal urinarybladder tissue(P<0.01). Conclusion： At both protein and gene levels，the E-cadherin expression level is lower in the urinary bladder cancer tissue than that in the normal urinary bladder tissue.

　　Key words: E-cadherin; urinary bladder cancer; tissue; immunohistochemistry; RT- PCR

　　膀胱癌是泌尿系统肿瘤中最常见的一种原发于膀胱上皮细胞的恶性肿瘤，是一类恶性程度较高的疾病。膀胱癌的发病因素包含很多，其中主要是与患者的基因和环境因素有关。在以往研究中发现，膀胱癌的发生是由膀胱细胞内单个或多个基因的改变决定的，主要是癌基因的激活和抗癌基因的失活，因此，对膀胱的分子遗传学研究不仅有助于肿瘤的诊断及预后判断，而且对肿瘤发病机制及肿瘤基因的研究均有着十分重要的意义。现在膀胱肿瘤的标记物有许多，我们主要研究的是E-钙黏素(E-cadherin，E-cad)，E-cad基因定位于16q22.1，cDNA全长48kb，开放阅读框架长2652bp，编码含884个氨基酸的多肽[1];基因组DNA长达100kb，含16个外显子，15个内含子。E-cad在体内有两种存在形式，组织型和可溶型[2]。研究发现E-cad是维持组织结构稳定，使细胞能正常有序的进行增殖、分化，从而避免细胞失控性生长，而抑制肿瘤的形成。但是在肿瘤细胞中，特别是恶性肿瘤中发现E-cad的功能会出现不稳定，主要表现是表达下降、缺失，或者是E-cad与细胞骨架连接的破裂，异常定位[3]。以往的研究主要是通过免疫组织化学方法进行研究，本次实验采用免疫组织化学和RT-PCR法检测E-cad在正常膀胱组织和膀胱癌组织中的表达，通过分析正常膀胱组织和膀胱癌　　组织中E-cad的蛋白水平上的表达和基因水平上的表达相互关系，为膀胱癌的发生、诊断以及治疗提供基础理论依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验材料

　　新鲜的正常膀胱组织10例，膀胱移行细胞癌组织31例，标本来自佳木斯大学附属第一医院和佳木斯市中心医院。

　　1.2 实验主要试剂

　　琼脂糖(美国Sigma公司)，Trizol(美国Invitrogen公司)，引物、GAPDH、DEPC、RNA提取试剂盒(上海生工生物工程技术有限公司)、Taq DNA聚合酶、2000bpMarker、反转录试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)，兔抗人E-cad 多克隆抗体、枸橼酸缓冲液、PBS缓冲液、DAB显色试剂盒、SABC试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

　　1.3 实验方法

　　RT-PCR法提取RNA及逆转录反应所使用的所有器具均在使用前经浓酸浸泡过夜，流水冲净后，0.1%的焦碳酸二乙酯 (DEPC)水浸泡过夜，高温高压灭菌后烤干密封保存备用。PCR操作所用耗材只需高温高压蒸气灭菌。

　　1.3.1 提取总RNA并检测其质量

　　匀浆处理组织，离心后取澄清的匀浆液加入氯仿，剧烈振荡。再次离心取上层水相转移到新的离心管中加入无水乙醇，混匀后离心弃掉流出液。重复上一步一次。再次离心去除残余液体。加入无RNase的水后离心，放置保存。溶解好的RNA溶液，加DEPC水稀释，微量比值，确定RNA纯度和浓度，糖凝胶电泳检测RNA的完整性。

　　1.3.2 反转录

　　依据试剂反应体系对提取的mRNA进行反转录，反转录后的cDNA-20℃保存。将反转录的cDNA扩增。

　　1.3.3 RT-PCR

　　标准曲线制备，琼脂糖凝胶电泳。利用天能GIS凝胶图像处理系统对RT-PCR实验所得凝胶进行分析，得出数据。

　　1.3.4 免疫组化(SABC)法 

　　取正常膀胱组织和膀胱癌组织的免疫组化标本按以下步骤进行：室温下，10%甲醛溶液浸泡标本24h。脱水，石蜡包埋，切片。常规石蜡切片脱蜡至水。甲醇-H2O2封闭内源性过氧化物，梯度乙醇水化后用PBS冲洗。微波修复后加血清覆盖组织(5%BSA)，水浴箱加热。加一抗，4℃冰箱过夜。PBS冲洗，加滴二抗，水浴箱加热，PBS冲洗后加SABC，再次水浴箱加热并冲洗。加DAB显色剂，静止，上色，入水阻断，苏木素复染。入水，入盐酸酒精，入水酚化，去兰。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，树脂封片，光镜下观察，计数、拍照。

　　1.4 结果评定

　　染色结果判定： E-cad阳性细胞为细胞膜或细胞浆着棕黄色，细胞膜染色呈颗粒或线状，细胞浆染色呈斑片状。E-cad表达分 3 级：阴性(-)，细胞无棕色染色且阳性细胞数 <10%;阳性(+)，细胞浅棕黄色染色且阳性细胞数为 10%～50%;强阳性(++)，细胞棕黄色染色且阳性细胞数>50%。

　　1.5 统计学处理

　　应用SPSS16.0 For Windows软件进行统计分析。

　　2 结果

　　2.1 RT-PCR法E-cad的检测

　　E-cad在膀胱癌组织中光密度值明显低于正常膀胱组织的光密度值见表1，E-cad在膀胱癌组织的表达明显低于正常膀胱组织的表达。RT-PCR法检测E-cad在正常膀胱组织和膀胱癌组织的光密度值变化 

　　2.2 免疫组化E-cad的检测

　　正常膀胱黏膜组织为阳性表达，膀胱发生癌性病变时表达低或不表达。通过免疫组化法发现E-cad在膀胱癌组织中的阳性表达率为32.39%(23/71)，正常膀胱黏膜组织表达的阳性率为100%，E-cad在膀胱癌组织中的表达明显低于正常组织。免疫组化 法分析E-cad在正常膀胱组织和膀胱癌组织的表达

　　3 讨论

　　近年来研究发现E-cad在膀胱中具有黏附性，在正常膀胱黏膜中的E-cad均会出现阳性表达，膀胱癌E-cad出现低表达或不表达[4，5]。本实验使用免疫组织化学方法对正常膀胱组织和膀胱癌组织中的E-cad进行了检测，发现E-cad蛋白在膀胱癌组织中的阳性表达率为32.39%(23/71)，正常膀胱黏膜组织表达的阳性率为100%，E-cad在膀胱癌组织中的表达明显低于正常组织。本实验通过RT-PCR法从基因水平检测正常膀胱组织和膀胱癌组织中E-cad的表达，E-cad在正常膀胱组织所得光密度值高于膀胱癌组织的光密度值，经统计学分析，E-cad在膀胱癌组织中的表达与正常膀胱组织表达相比差异有显著性。无论是在蛋白水平还是基因水平上，E-cad在膀胱癌组织中的表达都低于正常膀胱组织的表达。这提示E-cad抑制在膀胱癌的发生、发展过程中起重要作用。通过本次实验研究能为膀胱癌的发生、诊断和治疗等提供一定的基础理论依据。

　　【参考文献】

　　[1] Berx G, Staes K, Van Hengel J,et al.Cloning and characterization ofthe humen in vasion supperssor gene E-cadherin(CAH1)[J].Genomics,1995,26(2):281 289

　　[2] Matsuyoshi N, Tanaka T, Okamoto H,et al. Solube E-cadherin a novel cutaneous disease marker[J].Br J Dermatol,1995,132:745 749 

　　[3] Frixen UH, Nagamine Y. Stimulation of urokinase-type plasminogen activator expression by blockage of E-cadherin-dependent cell-cell adhesion[J]. Cancer Res，1993,53(15):3618 3623 

　　[4] 代新年，杨丰，纪祥瑞.E-cad、β-cat和Ki-67在膀胱癌的表达及意义[J].实用医药杂志，2008，8：900 902

　　[5] 许励，汤琪乐，徐文娟，等.E-cadherin、α-catenin和MMP2在膀胱癌中的表达及预后意义[J].诊断病理学杂志，2003，6：171 173