苦参碱诱导大鼠肝星状细胞凋亡的体外研究
发表时间：2011-06-30 浏览次数：431次
作者：翁山耕,胡雨云,田雄英,林丽娟,林永堃 作者单位：福建医科大学附属第一医院肝胆胰外科，福建省腹部外科研究所，福州 350004
【摘要】 目的 研究苦参碱对体外培养的大鼠肝星状细胞系rHSC-99凋亡的影响，并探讨其机制。 方法 体外培养rHSC-99，随机分成4组：对照组(A组)，苦参碱0.12 mg/kg组(B组)，苦参碱0.24 mg/kg组(C组)，苦参碱0.48 mg/kg组(D组)。苦参碱作用24 h后，TUNEL法检测rHSC-99凋亡，半定量RT-PCR方法及免疫细胞化学方法检测rHSC-99中神经生长因子(NGF)，p75及Caspase-3的表达情况。 结果 不同浓度的苦参碱干预rHSC-99 24 h后，rHSC-99凋亡率随苦参碱的浓度增大而增高，D组凋亡率最高(P<0.01);NGF，p75，Caspase-3 mRNA及其蛋白表达随苦参碱的浓度加大而表达升高，C组表达最高(P<0.01)。 结论 苦参碱可诱导HSCs凋亡。激活NGF/p75通路、上调Caspase-3蛋白表达可能是苦参碱诱导肝星状细胞凋亡的机制之一。
【关键词】 苦参碱; 星形细胞; 肝硬化; 细胞凋亡; 神经生长因子类; 神经组织蛋白质类; 基因表达
肝纤维化是慢性肝病发展为肝硬化的中间环节，肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSC)的活化在此过程中起关键作用。近来研究表明，逆转肝纤维化关键在于减少活化型HSC的数量，而凋亡是减少活化型HSC数量的主要途径[1]。已发现苦参碱能诱导大鼠肝星状细胞凋亡[2]。本实验观察苦参碱对体外培养的HSC凋亡的影响，并探讨其可能的机制。
1 材料和方法
1.1 材料 大鼠肝星状细胞系rHSC-99系保持体外培养激活的HSC特性[3];苦参碱注射液(斯巴特康，广州明兴制药有限公司，10 mg/mL，每支5 mL，批号：MD2101-2);RPMI 1640培养基﹑胰酶﹑新生牛血清(美国Gibco公司);NGF多抗及免疫细胞组化SABC试剂盒(武汉博士德公司);逆转录试剂盒、Taq酶、DNAmarke(美国MBI公司);总RNA提取试剂Trizol(美国Invitrogin公司);原位细胞死亡检测试剂盒(北京中山生物技术有限公司);引物由上海生工生物有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 rHSC-99细胞培养 含10%新生牛血清的RPMI 1640培养液、37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养，隔天换液，待细胞长至80%密度时，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶4传代。
1.2.2 分组 取生长良好的rHSC-99，48孔板(免疫细胞化学法和TUNEL检测)或6孔板(RT-PCR检测)。培养24 h后再用无血清的RPMI 1640液培养24 h，随机分为：对照组(加PBS，A组);苦参碱0.12 mg/mL组(B组);苦参碱0.24 mg/mL组(C组);苦参碱0.48 mg/mL组(D组)。药物作用24 h后，分别进行形态学观察及以下各项检测。
1.2.3 TUNEL法检测HSC的凋亡 各组均设3个复孔。按TUNEL试剂盒说明书操作。
1.2.4 RT-PCR检测NGF，p75，Caspase-3的mRNA表达 0.25%胰酶消化并离心收集细胞。按Trizol法提取总RNA，逆转成cDNA。PCR反应体系25 μL：10×buffer 2.5 μL，2 mmol/L dNTP 2.5 μL，MgCL2 1.5 μL(25 mmol/L)，Cdna 2 μL，Taq酶0.625 U，β-actin上下游引物各0.5 μL(10 pmol/μL)，p75或NGF或Caspase-3上下游引物(表1)各0.5 μL(10 pmol/μL)，去离子水补足至25 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min，进入热循环：95 ℃变性45 s→57 ℃退火45 s→72 ℃延伸50 s，28个循环，最后一个循环后72 ℃继续延伸10 min。取8 μL产物加溴酚兰2 μL混合后经2%琼脂糖凝胶电泳，图象分析仪扫描得出峰值，半定量分析，以p75/β-actin、NGF/β-actin、Caspase-3/β-actin作为其mRNA表达量。
1.2.5 免疫细胞化学法检测NGF，p75，Caspase-3蛋白表达 各组均设3个复孔，按SABC试剂盒说明进行操作。显微镜下观察着棕黄色的为表达阳性细胞(凋亡细胞)，摄片。免疫细胞化学实验结果采用H-score法评分法分析。
1.3 统计学处理 数据以x±s表示，采用SPSS11.5软件系统分析，单因素方差分析检验，Kruskal-Wallis H检验比较凋亡率。福建医科大学学报 2009年11月 第43卷第6期翁山耕等：苦参碱诱导大鼠肝星状细胞凋亡的体外研究表1 引物序列
2 结 果
2.1 形态学观察 培养的rHSC-99在苦参碱作用后细胞形态发生明显改变。对照组HSC呈星形，芒状突起丰富，高倍镜下细胞核呈圆形或不规则形，核仁圆形，清晰可见。苦参碱作用组较对照组细胞明显减少，细胞间隙较宽，细胞呈圆形，细胞内出现大量空泡，随苦参碱浓度增加，上述改变愈加明显(图1)。A:空白对照组; B：苦参碱作用组.
2.2 TUNEL法检测HSC的凋亡 A，B，C，D组HSC凋亡率为(0.76±0.35)%，(4.42±1.59)%，(7.83±1.60)%，(15.92±1.57)%。B，C，D组与A组比较，差别具有统计学意义(H=17.86，P<0.01)。D组HSC凋亡率最高(图2)。
光镜下细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞. A：对照组;B：0.12 mg/mL苦参碱组;C：0.24 mg/mL苦参碱组;D：0.48 mg/mL苦参碱组.
2.3 RT-PCR法检测NGF，p75，Caspase-3 mRNA表达
2.3.1 RT-PCR检测NGF mRNA表达 B，C，D组NGF mRNA表达分别为(0.409±0.074)，(0.724±0.109)，(0.560±0.104)，与A组(0.291±0.086)比较，差别有统计学意义(F=83.908，P<0.01)。C组NGF mRNA表达最高(图3A)。
2.3.2 RT-PCR检测p75 mRNA表达 B，C，D组p75 mRNA表达分别为(0.156±0.028)，(0.562±0.097)，(0.190±0.079)。与A组(0.079±0.016)比较，差别有统计学意义(F=231.776，P<0.01)。C组p75 mRNA表达最高(图3B)。
2.3.3 RT-PCR检测Caspase-3 mRNA表达 B，C，D组Caspase-3 mRNA表达分别为(0.358±0.065)，(1.051±0.113)，(0.661±0.072)。与A组(0.358±0.065)比较，差别有统计学意义(F=126.271，P<0.01)。C组Caspase-3 mRNA表达最高(图3C)。
2.4 免疫细胞化学法检测NGF，p75，Caspase-3蛋白表达
2.4.1 NGF蛋白表达 NGF在细胞质表达，细胞质呈着棕黄色染色的为阳性细胞。A，B，C，D组NGF蛋白表达分别为(1.750±0.156)，(2.140±0.186)，(2.810±0.198)，(1.850±0.149)。与A组比较，B，C，D组的NGF蛋白表达增加，差别有统计学意义(F=68.724，P<0.01)。C组NGF表达最强(图4A)。
2.4.2 p75蛋白表达 p75在细胞核表达，细胞核呈着棕黄色染色的为阳性细胞。A，B，C，D组p75蛋白表达分别为(1.710±0.157)，(2.210±0.170)，
A：NGF(神经生长因子)mRNA;B：p75 mRNA;C：Caspase-3 mRNA;①：β-actin，225 bp;②：NGF，467 bp;③：p75，386 bp;④：Caspase-3，342 bp;A：空白对照组;B：0.12 mg/mL苦参碱组;C：0.24 mg/mL苦参碱组;D：0.48 mg/mL苦参碱组;M：marker.
A: NGF蛋白表达，细胞质呈着棕黄色染色的为阳性细胞;B：p75蛋白表达，细胞核呈着棕黄色染色的为阳性细胞;C：Caspase-3蛋白表达，细胞质呈着棕黄色染色的为阳性细胞.
(2.730±0.988)，(1.980±0.146)。与A组比较，B，C，D组的p75蛋白表达增加，差别有统计学意义(F=5.574，P<0.01)。C组p75表达最强(图4B)。
2.4.3 Caspase-3蛋白表达 Caspase-3在细胞质表达，细胞质呈着棕黄色染色的为阳性细胞。A，B，C，D组Caspase-3蛋白表达分别为(0.850±0.102)，(1.910±0.158)，(2.610±0.189)，(2.350±0.176)。与A组比较，B，C，D组的Caspase-3表达增加，差别有统计学意义(F=98.757，P<0.01)。C组Caspase-3表达最强(图4C)。
3 讨 论
肝纤维化是慢性肝病发展为肝硬化的中间环节，是一个多环节的发生发展过程。其中HSC的活化在此过程中起关键作用。研究表明，逆转肝纤维化关键在于减少活化型HSC的数量，而凋亡是减少活化型HSC数量的主要途径[1]。
防治肝纤维化缺乏有效方法。近年发现苦参碱等某些中草药具有抗肝纤维化作用，成为研究热点。在既往研究中发现苦参碱能诱导大鼠肝星状细胞凋亡[2]，但其机制不明。HSC的凋亡可通过Fas/FasL、TRAIL/TRAILR、NGF/p75、线粒体途径等多种途径来介导。NGF是一种小分子多肽，与动物的神经细胞的生长、分化和凋亡相关。NGF有高亲和力受体trkA和低亲和力受体p75两种受体[4]，其中p75是一种糖蛋白，属肿瘤坏死因子受体超家族成员。NGF与trkA结合后促进神经细胞的生长和存活，与p75结合却诱导神经细胞凋亡。p75介导的凋亡过程与多种、激酶有关。其中丝裂原相关的蛋白激酶、JNK、Caspase等起着重要作用[5]。
Trim等发现，活化型HSC能表达p75，而静止型HSC以及肝脏中的其他细胞成分都不表达p75;NGF与活化型HSC表面p75结合后，导致HSC凋亡[6]。David等发现人与大鼠的肝细胞可检测出TrkA mRNA，而HSC表达p75及NGF[7]。以上证据显示p75/NGF途径是一条有选择性的HSC凋亡途径，它可以选择性促进活化型HSC凋亡，而肝细胞却不受损害，这可能是机体在肝脏受损时对抗肝纤维化一种有效保护措施，也将成为逆转肝纤维化治疗的一种策略。
本实验结果显示，随着苦参碱浓度增加，凋亡率升高，且在苦参碱浓度为0.48 mg/mL时升至高峰，证实苦参碱具有诱导HSC凋亡的作用，与田雄英的报道相符[2]。本实验还证实HSC能表达NGF及其受体p75[7]。实验发现，各实验组的NGF、p75、Caspase-3的mRNA和蛋白表达都随着苦参碱浓度增大而增强，在苦参碱浓度为0.24 mg/mL时达到高峰。在正常情况下，Caspase-3蛋白是以活性很低的酶原形式合成，包括氨基酸原域、大亚单位(约20 KD)、小亚单位(约10 KD)组成，通过蛋白酶水解去除氨基酸的一段序列而被激活。本实验免疫组织化学所用的抗体是特异地针对Caspase-3 活化后酶解的P20亚单位，结果显示空白对照组中Caspase-3表达不明显，表明在正常体外培养的无干预的HSC中，Caspase-3是以活性很低的酶原形式存在。在低浓度的苦参碱作用后Caspase-3便开始大量表达，可见Caspase-3与HSC凋亡的密切相关。以上结果提示，苦参碱可能是通过NGF/p75途径，上调Caspase-3的表达诱导HSC凋亡。
本组实验中，HSC的凋亡高峰却在0.48 mg/mL时发生，与NGF、p75、Caspase-3的表达不同步。说明信号转导启动至凋亡的发生存在时间差。苦参碱促进HSC凋亡的机制极为复杂，其间可能有多条信号转导途径参予，有待进一步探讨。
【参考文献】
[1] Kweon1 Y,Paik1 Y,Schnabl B,et al. Gliotoxin-mediated apoptosis of activated human hepatic stellate cells[J]. J Hepatology, 2003,39(4):38-46.
[2] 田雄英,翁山耕,林永堃,等. 苦参碱对大鼠肝星状细胞增殖和凋亡的影响[J]. 肝脏, 2005,10(2):95-97.
[3] 冷希圣,翁山耕,李 涛,等. 大鼠肝星状细胞系的建立及其生物学特性的研究[J]. 解剖学报, 2003,34(3):272-277.
[4] Niederhauser O,Mangold M,Schubenel R,et al. NGF Ligand Alters NGF Signaling Via p75(NTR) and TrkA[J]. J Neurosci Res, 2000,61(4):263-272.
[5] Eggert A,Sieverts H,Ikegaki N,et al. p75 mediated apoptosis in neuroblastoma cells is inhibited by expression of TrkA[J]. Med Pediatr Oncol, 2000,35(3):573-576.
[6] Trim J E,Samra S K,Arthur M J,et al. Upstream tissue inhibitor of metalloproteinases-1(TIMP-1)element-1, a novel and essential regulatory DNA motif in the human TIMP-1 gene promoter, directly interacts with a 30-kDa nuclear protein[J]. J Biol Chem, 2000,275(9):6657-6663.
[7] Cassiman D,Denff C,Desmet V J,et al. Human and rat hepatic stellate cells express neurotrophins and neurotrophin receptors[J]. Hepatology, 2001,33(1):148-158.
