前癃通胶囊对体外培养人BPH前列腺组织块凋亡的影响

　　作者：朱闽,贺菊乔　　作者单位： 南宁市，广西中医学院附属瑞康医院男性科(朱闽);湖南中医药大学第一附属医院外科(贺菊乔)

　　【摘要】目的探讨前癃通胶囊对前列腺组织块细胞凋亡的影响。方法采用组织块培养法，体外对良性前列腺增生(BPH)患者的前列腺组织块进行培养;用免疫组化法检测前癃通对体外培养的前列腺组织块细胞凋亡指数表达的影响。结果 前癃通能促进BPH细胞凋亡，前癃通各剂量组的前列腺组细胞凋亡指数都有不同程度上升，与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.01)，且对细胞凋亡的促进作用表现出明显的量效关系。结论 前癃通胶囊能提高凋亡指数在体外培养BPH前列腺组织块细胞中的表达，这可能是前癃通胶囊治疗BPH的机制。

　　【关键词】 前癃通胶囊,前列腺组织块,凋亡指数

　　良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia,BPH)是老年男性最常见的疾病之一,研究表明BHP中细胞增殖和凋亡均呈增加趋势，只是凋亡细胞数量的增加远远低于增殖细胞的数量，凋亡处于相对减少的状态[1]。干预凋亡指数(apoptosis index，AI)的表达在研究BPH的防治中具有非常重要的意义。前癃通胶囊是贺菊乔教授多年的临床经验方，由黄芪、田三七、丹参、蒲黄、王不留行等药物组成,本实验观察了其对体外培养BPH前列腺组织块AI表达的影响,报告如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 本实验培养用的前列腺组织块取自手术室无菌条件下经耻骨上前列腺摘除术切除的前列腺标本，每份标本重量2～3 g，经组织学证实为BPH组织。将手术切除的新鲜前列腺标本迅速放入4℃预冷细胞洗涤液内，冰浴状态下带回实验室。

　　1.2 试剂与仪器 1640基础培养液(美国Gibco公司);无菌胎牛血清(购于湖南利欣生物公司);凋亡试剂盒(购于湖南利欣生物公司);二氨基联苯胺(DAB)(北京中山生物技术有限公司)。CO2恒温培养箱(TC2323型、美国Sheloln公司);电热恒温水箱 (DK600型，上海精宏实验设备有限公司);超纯水系统(LABCONCOwpc900602型，美国);手提式压力蒸汽灭菌器(YXQ.SG46.280型，北京医用核子仪器厂);超净工作台(苏州安泰空气净化技术公司);相差倒置显微镜(ECLIPSETE300型、日本Nikon公司);96孔培养板、25 cm2培养瓶(日本Nuco公司出品)。

　　1.3 实验药物 前癃通胶囊：由湖南中医药大学第一附属医院制剂室提供，0.5 g/粒(含生药0.5 g，批号：000605)。根据药物细胞毒性实验结果，选取高剂量组(6.25 mg/L)、中剂量组(3.13 mg/L)、低剂量组(1.56 mg/L)，3种不同剂量药液，以1 500 r/min离心去除沉淀，用0.22 μm微孔滤膜滤过除菌，4℃保存备用。他莫昔芬片：由山东健康药业有限公司生产，批号：1210016，10 mg/片。取他莫昔芬20 g，用Hank’s液溶解,用细胞培养液稀释配制成1 ng/ml，1 500 r/min离心去除沉淀，用0.22 μm微孔滤膜滤过除菌，4℃保存备用。1.4 实验方法

　　1.4.1 前列腺组织块的培养：参照文献[2]进行培养。在倒置相差显微镜下观察组织块形态，在组织块相互融合后进行药物干预。

　　1.4.2 干预方法：取制备好的前列腺组织块于50 cm2培养瓶，分3组给予不同剂量药物及对照药物处理，同时设空白对照组和模型组。重复5瓶,培养5～7 d后观察。

　　1.4.3 指标测定方法:①将培养的组织块以4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，间断连续切片;②新鲜配制3% H2O2溶液，室温处理10 min，蒸馏水洗涤2 min×3次;③加入0.1 mol/L TBS 1∶200新鲜稀释Prooteinase K 37℃消化1～15 min，0.1 mol/L TBS洗涤2 min×3次;④加标记缓冲液20 μl/片，以保持切片湿润。按每张切片取TdT和DIGdUTP各1 μl，加入18 μl标记缓冲液中，混匀。甩去切片上多余液体后加标记液，20 μl/片。置样品于湿盒中，37℃标记2 h;⑤0.1 mol/L TBS洗涤2 min×3次，加封闭液50 μl/片，室温30 min，甩掉封闭液，不洗;⑥封闭液1∶100稀释生物素化抗地高辛抗体，50 μl/片加至片上，置样品于湿盒中，37℃反应30 min，0.1 mol/L TBS洗涤2 min×3次;⑦0.1 mol/L TBS 1∶100稀释SABC：取1 ml 0.1 mol/L TBS加SABC 10 μl，混匀后加至切片，37℃反应60 min，0.1 mol/L PBS洗5 min×4次;⑧DAB染色：去1 ml蒸馏水，分别加入DAB试剂盒中A、B、C试剂各一滴，混匀后加至标本片上，显色10～30 min左右，水洗;⑨苏木素轻度复染，0.1 mol/L TBS洗，蒸馏水洗，脱水，透明，封片。光镜下观察，AI测定。

　　1.5 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，2组间比较采用q检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　他莫昔芬组与前癃通各剂量组的前列腺组织块细胞AI都有不同程度上升，与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.01);前癃通高、中剂量组之间比较，差异无统计学意义(P>0.05)，高、中剂量组与低剂量组比较，差异有统计学意义(P<0.01);高、中剂量组与他莫昔芬组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，低剂量组与他莫昔芬组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。表1 前癃通胶囊对前列腺细胞AI的影响注：与他莫苷芬组比较，*P<0.05;与模型组比较，#P<0.01;与低剂量组比较，△P<0.01

　　3 结论

　　细胞凋亡是个体发育过程中在基因调控下的细胞自杀活动，是多细胞有机体为调控机体发育，维护内环境稳定，由基因编码程序的细胞主动死亡过程。凋亡细胞有其独特的形态和生物学特征：细胞核染色质固缩，DNA广泛降解断裂，细胞全面皱缩，细胞膜皱缩外突包裹细胞器(如线粒体、核糖体)和核片断形成特征性的凋亡小体。近年来，许多学者对细胞凋亡与BPH的关系做了大量的研究，其研究表明与BPH发生密切相关的凋亡因子有：bcl2、bax、Fas、Fas1、ICE、P53、caspase3、NOS等，这些基因在一定条件下会引起特异型细胞发生与凋亡有关的变化，从而对细胞凋亡进行调控。bcl2蛋白水平增高则抑制细胞凋亡，bcl2的过量表达除了在缺乏生长因子状态下延缓细胞死亡外，还能显著地阻止或减少各种刺激引起的细胞杀伤，在BPH中的表达显著高于正常前列腺组织[3-6]，Bax具有促进细胞凋亡的作用，在BPH中呈低表达，从而提示BPH的发病与细胞凋亡减少有关[7]。但有研究表明BHP中细胞增殖和凋亡均呈增加趋势，只是凋亡细胞数量的增加远远低于增殖细胞的数量，凋亡处于相对减少的状态[8]。

　　前癃通胶囊是贺菊乔教授临床应用多年，治疗BPH有较好疗效的经验方，具有益气利水、活血散结之功效。经临床应用证实，该药疗效确切。并在前期实验研究中证实，该药对人前列腺基质细胞TGFβ1有抑制作用[9]。本研究通过观察对前癃通胶囊对体外培养前列腺组织块细胞AI表达的影响，结果表明前癃通胶囊能提高AI在体外培养BPH前列腺组织块细胞中的表达，可能是前癃通胶囊治疗BPH症的机制。同时该结果为我们进一步研究凋亡因子对前列腺细胞的影响提供了参考依据。

　　【参考文献】

　　1 杨金瑞,黄循,杨竹林.前列腺增生和前列腺癌组织细胞凋亡及Bcl2、Bax基因表达的研究.中华泌尿外科杂志,2000,21:485487.

　　2 鄂征主编.组织培养和分子细胞学技术.第1版.北京:北京出版社,2001.3538.

　　3 Royuela M,De Miguel MP，Bethencourt FR,et al.IL2 its receptors.and bcl2 and bax genes in normal.Hyerplastic and carcinomatous human prostates:immunohistochemical comparative analysis.Growth Factors,2000,18:135146.

　　4 Hegarty M，Paul K,Watson R，et al.Effects of cyclic stretch on prostatic cells in culture.J Urol,2002,168:22912295.

　　5 Wang W，Bergh A，Damber JE.Chronic inflammation in benign prostate hyperplasia is associated with focal upregulation of cyclooxygenase2.Bcl2 and cell proliferation in the glandular epithelium.Prostate,2004,61:6072.

　　6 贾彬,蔡文清,黎伟,等.雌激素对前列腺增生症移行区细胞Bcl2,Bax和Cmye基因表达的影响.中华实验外科杂志,2004,21:7778.

　　7 GandourEdwards R，Mack PC，DevereWhite RW,et al.Abnormalities of apoptotic and cell cycle regulatory proteins in distinct histopathologic components of benign prostatic hyperplasia.Prostate Cancer Prostatic Dis,2004,17:10381041.

　　8 杨金瑞,黄循,杨竹林.前列腺增生和前列腺癌组织细胞凋亡及Bcl2、Bax基因表达的研究.中华泌尿外科杂志,2000,21:485487.

　　9 李翠英，周亮.前癃通胶囊对体外培养基质细胞TGFβ1表达干预作用的研究.中国中医药科技，2005，12：7576.