普通PCR与TDPCR在临床医学科研中应用价值的比较

　　作者：王楠，王养民，张斌 作者单位：兰州大学临床医学院，甘肃 兰州 730000;解放军兰州军区兰州总医院全军泌尿外科中心，甘肃 兰州 730050

　　【摘要】目的 比较普通聚合酶链反应(PCR)与降落聚合酶链反应(Touchdown PCR，TDPCR)在临床医学科研中的价值。方法 以人类外周血基因组DNA为模板，设计VHL基因3个外显子的3对引物，根据普通PCR及TDPCR原理设计包括3个外显子片段在内的PCR程序，通过试验选择PCR最佳反应条件，在同一程序中分别对3个片段进行扩增，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，纯化后PCR产物测序分析两种试验方法的差别。结果 电泳检测及纯化后DNA产物测序分析均显示TDPCR扩增产物条带特异性、效率较普通PCR扩增产物高。结论 成功建立了TDPCR方法，TDPCR方法较普通PCR更为高效实用，为临床基因突变筛查研究提供了快速可靠的手段。

　　【关键词】 基因 聚合酶链反应 降落聚合酶链反应

　　Application of Ordinary PCR and TDPCR to Clinical Medicine

　　Wang Nan, Wang Yangmin, Zhang Bin

　　(Clinical Medical College of Lanzhou University, Lanzhou, 730000, China; Department of Urology, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Region, PLA, Lanzhou 730050, China)

　　Abstract： Objective To compare the ordinary polymerase chain reaction (PCR) and touchdown (TD)PCR in clinical medical research. Methods We used genomic DNA from human peripheral blood as templates and designed three pairs of primers of VHL gene three exons. On the basis of the principle of PCR and TDPCR, we designed the programs, including the three exons. We chose the better reaction conditions through the PCR tests. The same programs were carried out on three fragments. The PCR products were detected by gel agarose electrophoresis. We analyzed the difference between the two methods by sequencing purified PCR products. Results It was indicated that TDPCR was more specific and effective than ordinary PCR, according to electrophoresis detection and sequencing analysis. Conclusion TDPCR, which acts as a rapid and reliable method, is more efficient than ordinary PCR for clinical gene mutation screening.

　　Key words： gene; polymerase chain reaction; touchdown polymerase chain reaction

　　自从20世纪80年代中期以来，聚合酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR)作为一种体外扩增DNA的方法，在分子生物学、法医学及一些人类基因疾病诊断等方面起到越来越重要的作用。PCR所具有的3个突出的特点(即选择性，特异性和快速性)，使得DNA的克隆和操作变得十分简单。目前在一些临床基因突变筛查研究中，PCR作为基本实验手段，得到了广泛的应用,尽管如此，许多PCR实验中不但经常出现假阳性，而且实验结果往往并不太令人满意，也会造成无PCR产物，或电泳中出现大量非特异性二聚体条带。降落聚合酶链反应(Touchdown PCR，TDPCR)，最初是用于克服PCR中的假引发，作为一种行之有效的DNA体外扩增方法，在许多普通PCR无产物的基因扩增，都采用TDPCR，因此我们在VHL基因突变筛查中使用了普通PCR和TDPCR两种方法，并同时使用了TaKaRa Taq Hs进行了实验，期望能够得到良好的实验结果及建立TDPCR方法。

　　1 材料与方法

　　1.1 PCR扩增引物及模板 引物设计参考文献[1]，由大连宝生物工程有限公司合成。两组实验均以1例健康人类外周血基因组DNA为模板，外周血DNA提取采用大连宝生物工程有限公司D9081血液基因组提取试剂盒,严格按照说明书提取基因组DNA。

　　1.2 PCR扩增条件 50 μl 反应体系中包括：大连宝生物工程有限公司DR028A PCR混合浓缩试剂(Premix Taq Hot Start Version)25 μl，100 μmol/L 上下游引物各0.2 μl，基因组DNA100～200 ng，灭菌超纯水20.6 μl。

　　1.3 PCR扩增试剂及仪器 本次实验中使用的DR028A PCR混合浓缩试剂中含有的TaKaRa Taq Hs是抗Taq抗体和TaKaRa Taq的混合物，高温变性前抗Taq抗体与Taq酶结合，抑制聚合酶活性，能在低温条件下抑制引物的非特异性退火及引物二聚体的非特异性扩增，抗Taq抗体在PCR反应最初的DNA变性步骤中变性，无需特殊失活处理，在常规PCR条件下即可使用，同时PCR扩增产物3’末端含有一个“A”碱基，可直接连接T载体克隆。PCR所用仪器为美国ABI公司GeneAmp PCR System 9700型。

　　1.4 设计降落PCR程序 参考文献[2]所建议的TDPCR引物设计原则[从高于融解温度(Tm)值10 ℃，每次降低1 ℃(最终降至Tm值)]并做适当修改，对3对引物的Tm值进行预测，并根据全部退火温度值设定PCR循环程序中的温度变化范围，为照顾到3个片段，退火温度在最高65 ℃ 最低55 ℃ 的范围内，比较温度梯度以每降低1 ℃ 循环2次、最后在60～72 ℃ 再循环15次等一系列程序的扩增效果。

　　1.5 PCR 程序

　　1.5.1 普通PCR程序 循环参数为95 ℃ 预变性5 min，95 ℃ 变性45 s，第1、2和第3外显子的退火温度分别为63 ℃、59 ℃、57 ℃，退火45 s，72 ℃ 延伸45 s，30个循环后，72 ℃ 延伸10 min。

　　1.5.2 TDPCR程序 94 ℃ 预变性3 min;94 ℃ 46 s;65 ℃ 30 s，每次下降1 ℃ 直到55 ℃，每个温度上进行2轮循环反应;60 ℃45 s，72 ℃ 45 s，再循环15次;72 ℃ 延伸10 min;PCR产物在4 ℃ 下保存。

　　1.6 电泳 所有PCR产物均在2.0%(质量分数)琼脂糖凝胶中电泳，固定电压100 V。

　　1.7 纯化及测序 使用上海生工技术有限公司DNA胶回收试剂盒SK1132纯化PCR产物后，送该公司测序，所用测序仪器为ABI PRISM 3730，测序试剂为BigDye terminator v3.1。

　　2 结果

　　本次实验中用于扩增VHL基因的3个外显子和测序的引物见表1。TDPCR产物电泳结果未见非特异性二聚体，目的条带清晰明亮，见图1。普通PCR产物电泳结果可见大小约100 bp 左右的非特异性二聚体，同时加样孔下方带有部分片状拖带产物，目的条带较明亮清晰，见图2。TDPCR产物纯化后测序结果准确可靠，基本未见干扰波，见图3。普通PCR产物纯化后测序结果较准确可靠，在碱基G与A可见一蓝色干扰波，见图4。

　　表1 用于扩增VHL基因的3个外显子和测序的引物(略)

　　F：正向;R：反向

　　图1 TDPCR产物电泳结果(略)

　　图2 普通PCR产物电泳结果(略)

　　图3 TDPCR产物纯化后测序结果(略)

　　图4 普通PCR产物纯化后测序结果(略)

　　3 讨论

　　1991年Don等报道的TDPCR代表一种优化方法，其与普通PCR操作基本一致，只是编设一系列退火温度从较高温度开始逐步降低的循环反应程序，一组反应程序可同时扩增出不同特异性靶基因序列片段，并获得理想的扩增效果。该方法的基本原理是在设定程序时选择退火温度高于计算的Tm值10 ℃，随着循环的进行逐步降至Tm值，最终低至Tm值或低于Tm值5 ℃。这一方法可保障第一个引物与模板杂交发生在最互补的反应物(目的扩增片段)之间，任何不同的变性温度与不同的复性温度之间循环，能得到2倍增高的正确或不正确的产物，在随后的退火温度继续下降的过程中，上述的延伸合成会继续进行。最初设计TDPCR是为了降低普通PCR中出现的假阳性 ，因此TDPCR常用于存在假阳性的临床检测。此后Piraee M等人应用并改进了上述技术[3～5]。国内此项技术应用较少，仅见个别报道。万兵等在构建人CDl37hlgGlFcpCDNA3融合蛋白真核表达载体过程中运用TDPCR扩增目的基因[6]。张贵星等人在克隆盐藻D.bardawil的胡萝卜素生物合成相关(carotene biosynthesis related，cbr)基因的启动子过程中，对TDPCR进行了改进[7]。季策等人在建立拟南芥AtSUC9PCR反应体系时运用了TDPCR技术[8] 。

　　我们在本次实验中比较了普通PCR 和TDPCR间的特异性差别，并使用了含有抗Taq抗体的Taq酶(即TaKaRa Taq Hs)以期待达到PCR反应的最优化条件。实验结果均表明，在同样的最优化条件下及使用同一模板(1例健康人类外周血基因组DNA)情况下，普通PCR产物中仍出现非特异性二聚体及部分片状拖带，可能导致测序结果出现部分干扰波，TDPCR产物中未见非特异性二聚体及部分片状拖带，目的条带清晰明亮，由此可以证实TDPCR完全可以用于降低或避免由以下原因所致的假阳性：空气中的小片段核酸污染;短序列引物;非特异性扩增带;Tm(变性温度)值具有一定差距的1对引物;复杂的模板DNA，如基因组DNA。同时也说明TDPCR反应的扩增效率及特异性较普通PCR高，基本达到本次实验最高水平。综合比较普通PCR和TDPCR，我们认为前者虽然程序简单，在一般的PCR仪都可完成，但缺点是退火温度不适当时容易出现假阳性;而TDPCR虽然程序复杂，并需要PCR仪有较大的内存，但能非常有效地降低或避免假阳性，且在同样的工作条件(比如最佳Mg2+浓度、Taq酶)可扩增出更高特异性的产物。此次实验证实成功建立TDPCR的方法，仅需应用一套温度程序扩增，既可对VHL基因全部3个外显子进行检测，并能在1 d内完成。本方法的建立为VHL基因的突变筛查分析提供了快速可靠的方法，具有一定的临床研究使用价值。

　　【参考文献】

　　[1] 周大海,王养民,蓝 天,等.一个单纯家族性嗜铬细胞瘤家系的VHL基因突变筛查[J].中华医学遗传学杂志，2007,24(4)：365-368.

　　[2] Huang XQ, Cloutier S.Heminested touchdown PCR combined with primertemplate mismatch PCR for rapid isolation and sequencing of low molecular weight glutenin subunit gene family from a hexaploid wheat BAC library[J].BMC Genet. 2007,8:18.

　　[3] Piraee M,Vining LC.Use of degenerate primer and touchdown PCR to amplify a halogenase gene fragment from streptomyces venezuelae ISP5230[J].J Ind Microbiol Biotechnol，2002，29(1)：1.

　　[4] Fietto JL，DeMarco R，VerjovskiAlmeida S.Use of degenerate primers and touchdown PCR for construction of cDNA libraries[J]. Biotechniques，2002，32(6)：1404.

　　[5] Eldering JA, Felten C, Veilleux CA,et al.Development of a PCR method for mycoplasma testing of Chinese hamster ovary cell cultures used in the manufacture of recombinant therapeutic proteins[J]. Biologicals. 2004,32(4):183-193.

　　[6] 万 兵,闫 杰,李明春,等.一种优化的PCR方法—降落PCR扩增目的基因[J].江苏临床医学杂志,2002,6(2):127-129.

　　[7] 张贵星,袁保梅,许培荣,等.改良的降落PCR与普通PCR结果比较[J].郑州大学学报(医学版),2003,38(3):352-354.

　　[8] 季 策,张立军,阮燕晔,等.应用降落PCR和正交设计优化AtSUC9 PCR反应体系[J].生物技术，2007,17(4):39-42.