前列腺特异性膜抗原新型剪接变异体ＰＳＭ-Ｅ在外周血的定量表达

　　作者：瞿 虎， 陈 羽， 丘少鹏*， 毛晓鹏， 郭胜杰 作者单位：中山大学附属第一医院泌尿外科， 广东 广州 510080

　　【摘要】 【目的】 检测分析前列腺特异性膜抗原(PSMA)及其新型剪接变异体(PSM-E)在前列腺癌(PCA)及良性前列腺增生(BPH)患者外周血中的表达，探讨其意义。 【方法】 通过实时荧光定量PCR方法对PSM-E、PSMA在前列腺癌(53例)和前列腺增生(79例)两组患者外周血中定量表达，分析其差异。 【结果】 PSM-E相对表达量在PCA组(-8.22 ± 0.32)高于BPH组(-9.99 ± 0.41)，P < 0.001;PSMA相对表达量在PCA组(-12.51 ± 0.31)高于BPH组(-13.72 ± 0.48)，差异有统计学意义，P < 0.05; PCA组和BPH组内PSMA与PSM-E相对表达量有相关性(r = 0.36，P < 0.05; r = 0.65，P < 0.01)，与血清PSA均不相关。 【结论】 外周血定量检测PSM-E表达差异可用于区分良性前列腺增生和前列腺癌;与PSMA相比PSM-E表达量更高，其检测的灵敏度更高，PSM-E诊断前列腺癌的敏感性和特异性更好。

　　【关键词】 前列腺特异性膜抗原; PSM-E; 剪接变异体; 前列腺癌; 荧光定量PCR

　　Peripheral Expression and Clinical Significance of PSM-E： A New Spliced Variant

　　of PSMA Detected by Real time PCR

　　QU Hu， CHEN Yu， QIU Shao-peng*， MAO Xiao-peng， GUO Sheng-jie

　　(Department of Urology， The First Affiliated Hospital， SUN Yat-sen University， Guangzhou 510080)

　　Abstract： 【Objectives】 To detect the expression of PSMA and its new splicing variant PSM-E in prostate cancer and benign prostate hyperplasia patients by real-time PCR and to investigate its clinical significance. 【Methods】 The expression of peripheral PSMA and PSM-E in prostate cancer and benign prostate hyperplasia patients were detected by real-time PCR and the difference was analyzed. 【Results】 The relative expression of PSM-E was higher in the PCA group (-8.22 ± 0.32) than in BPH group (-9.99 ± 0.41)， P < 0.001. The relative expression of PSMA in the PCA group (-12.51 ± 0.31) was higher than BPH group (-13.72 ± 0.482)， with statistic significance， P < 0.05. The relative expression of PSMA was correlated with PSM-E in both PCA and BPH group while not correlated with PSA in either group. 【Conclusion】 The difference in peripheral PSM-E expression is useful in differentiation between BPH and PCA. PSM-E was better than PSMA in that it has higher expression and sensitivity and therefore it has better sensitivity and specificity in the diagnosis of PCA.

　　Key words： PSMA; PSM-E; spliced variant; prostate cancer; real-time PCR

　　[J SUN Yat-sen Univ(Med Sci)，2009，30(3)：294-298]前列腺特异性膜抗原(prostate-specific membrane antigen， PSMA)作为与前列腺癌密切相关的细胞跨膜蛋白，是近年来前列腺癌研究的热点，如针对国人PSMA基因的克隆鉴定等[1]。既往研究表明PSMA在前列腺癌及其转移灶中表达增高，其组织特异性明显优于前列腺特异性抗原PSA[2]。PSM-E是本研究组首次在世界上发现的一种新型PSMA剪接变异体，在前期研究中我们发现新剪接变异体PSM-E是一种较PSMA特异性更高的前列腺标记物，组织中PSM-E mRNA表达水平可用于区分正常前列腺、前列腺增生和前列腺癌[3]。本研究中我们采用实时荧光定量PCR方法检测新型剪接变异体PSM-E在前列腺癌及良性前列腺增生患者外周血中的表达，并与PSMA相对比，探讨其临床意义。

　　1 材料和方法

　　1.1 病例资料

　　选取2006年11月-2008年12月泌尿外科患者，前列腺癌(prostate cancer， PCA)患者53例，前列腺增生(benign prostate hyperplasia， BPH)患者79例。PCA纳入标准：病理证实为PCA，分期不限;BPH纳入标准：临床诊断及病理证实为BPH。随机编号，受试前1周禁止作前列腺直肠指诊，停用与雄激素有关的治疗。

　　1.2 仪器及材料

　　荧光定量PCR仪Chromo 4 Real-Time PCR Detector为美国MJ Research公司产品。淋巴细胞分离液为北京鼎国生物技术公司产品，总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒均为TOYOBO公司产品，SYBR GreenⅠ荧光定量PCR试剂盒购自Takara公司。PSM-E、PSMA重组质粒pcDNA3.0/PSM-E和pcDNA3.0/PSMA及内参基因β-actin质粒为本研究组此前已构建成功并保存。

　　1.3 引物序列

　　设计PSM-E、PSMA特异性引物以区分其它剪接变异体，同时将β-actin设为内参基因。引物均由Invitrogen公司合成。引物序列见表1。

　　1.4 外周血单个核细胞的提取

　　用EDTA抗凝管集取患者外周静脉血5 mL，按说明书操作收集有核细胞，保存于 -80 ℃ 保存备用。

　　1.5 总RNA的提取及反转录

　　总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒均为TOYOBO公司产品，按照说明书进行。

　　1.6 荧光定量PCR

　　荧光定量PCR反应体系：cDNA 模板3 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、SYBR Premix Ex TaqTM 12.5 μL、双蒸水8.5 μL，Total 25 μL;荧光定量PCR反应参数：共40循环，第一循环中94 ℃ 2 min;循环2-40：94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s;72 ℃ 20 s; 80 ℃ 1 s; Melting Curve 60 ～ 95 ℃，每1 ℃ 4 s。分别以质粒pcDNA3.0/PSM-E、pcDNA3.0/PSMA及自行构建的β-actin质粒作为扩增PSM-E、PSMA、β-actin的标准品，用核酸蛋白分析仪于260 nm 测定光密度值。根据测定的质粒浓度计算pcDNA3.0/PSM-E、pcDNA3.0/PSMA及β-actin的质粒拷贝数，公式如下：质粒copies = (OD260 × 稀释倍数 × 50 μg/mL × 10-6 × 6.02 × 1023 × 10-3)/(660 g/mo1 × 碱基对数)。

　　1.7 统计学处理

　　应用SPSS软件包对数据进行处理分析。上述荧光定量PCR分析得出的PSM-E、PSMA表达相对量原始数据直方图显示非正态分布，进行对数转换后其结果接近正态分布，采用t检验、方差分析、Pearson相关性分析等行统计分析。

　　2 结 果

　　2.1 两组PSM-E/PSMA相对表达量分析

　　前列腺癌(PCA)患者组内PSM-E的相对表达量为(-8.22 ± 0.32)，PSMA相对表达量为(-12.51 ± 0.31)，差值的均数为-4.29，P < 0.001。数据相关性检验，PCA组内PSMA相对表达量与PSM-E相对表达量数据相关，相关系数r = 0.36，P < 0.05。PSMA及PSM-E与TPSA数据均不相关。

　　前列腺增生(BPH)患者组内，PSM-E的相对表达量为(-9.99 ± 0.41)，PSMA相对表达量为(-13.72 ± 0.48)，差值的均数为 -3.73，P < 0.001。数据相关性检验，BPH组内PSMA相对表达量与PSM-E相对表达量相关，相关系数r = 0.65，P < 0.01。PSMA及PSM-E与TPSA数据均不相关。

　　PSMA表达在PCA组和BPH组间差异有统计学意义， t = 2.38， P < 0.05，PSM-E在PCA组和BPH组间差异有统计学意义，有显著性差异， t = 3.75， P < 0.001。

　　2.2 ROC曲线分析

　　ROC曲线(receive operating characteristic curve)，通过将连续变量设定出多个不同的临界值，从而计算出一系列敏感性和特异性，再以敏感性为纵坐标、(1-特异性)为横坐标绘制成曲线，曲线下面积越大，诊断准确性越高。在ROC曲线上最靠近坐标图左上方的点为敏感性和特异性均较高的临界值。ROC分析显示PSME在诊断PCA的敏感性和特异性方面要优于PSMA(图1)。

　　3 讨 论

　　在肿瘤的早期阶段就有癌细胞进入血循环，运用高灵敏度的方法检测外周血中的PSMA mRNA的表达将有助于PCA血行播散的判断及早期诊断，Israeli等[4-5]用高灵敏的聚合酶链反应技术(RT-PCR)检测PCA患者血标本，PSMA的特异性和敏感性优于PSA。Grasso等[6]用同样的方法进行研究得到同样的结果。国内的余斌等[7]的研究也表明用巢式RT-PCR检测外周血中PSMA及PSA，在PCA的诊断中PSMA的真实性和可靠性明显优于PSA，其特异性更高。PSMA存在可变剪接现象[8]，通过可变剪接可以改变原有蛋白的功能，并且与肿瘤的发生发展、侵袭转移有关，即可能形成对肿瘤的发生发展、侵袭转移有不同调控功能的蛋白质分子[9-10]。

　　3.1 新型剪接变异体PSM-E

　　新型剪接变异体PSM-E是本研究组于国家自然基金课题“基因重组酵母PSMA疫苗抗前列腺癌的实验研究”中[11]在构建PSMA全长的同时在世界上首次发现，与PSMA其他剪接变异体PSM′、PSM-C和PSM-D都位于胞内不同，是一种分子量为100 ku的跨膜蛋白。在此前研究的基础上我们采用荧光定量PCR的方法检测新型剪接变异体PSM-E在BPH及PCA患者外周血中的定量表达，并与PSMA相比较，分析其差异。

　　在本研究中PSMA及PSM-E的实时荧光定量PCR外周血检测检出低限可达到10-7，即其灵敏度达到在108个单核细胞中仅含有10个前列腺肿瘤细胞即可被检出[12]。当以10-7为检测低限时， PCA组患者中，PSMA的阳性检出率为79.25%(42/53例)，PSM-E的阳性检出率为81.13%(43/53例)，两者无显著性差异; BPH组患者中，PSMA的阳性检出率为40.51%(32/79例)，PSM-E的阳性检出率为51.90%(41/79例)。虽然PCA组阳性检出率无显著性差异，但定量PCR分析结果显示PSM-E的相对表达量在PCA组要高于BPH组;PSMA相对表达量在PCA组高于BPH组。PSM-E及PSMA在PCA患者外周血中的表达均高于BPH患者，PSM-E在两组间差异性更为显著，这表明采用实时定量PCR检测外周血中PSM-E的表达差异同PSMA检测一样可用以区分PCA患者和BPH患者。

　　组内分析显示两组内PSM-E的相对表达量皆高于PSMA的相对表达量，且两者相关，但两组内PSM-E及PSMA表达与血清PSA均不相关。与PSA为分泌型蛋白不同，PSMA及PSM-E为跨膜蛋白，外周血中PSMA及PSM-E的检出均与血循环中存在的前列腺(肿瘤)细胞数量密切相关，因此PSM-E与PSMA的相对表达量有相关性，但两者与血清PSA水平无关联。在PCA及BPH两组内PSM-E的相对表达量均明显高于PSMA，校正后的相对拷贝数表达PSM-E检测较PSMA要高出2 ～ 3个指数量级，这说明PSM-E在检测的灵敏度上要优于PSMA。

　　3.2 前列腺癌的筛查诊断指标

　　目前临床多采用血清PSA作为前列腺癌的筛查诊断指标[13]，然而PSA是一个组织特异性而非肿瘤特异性的标记物。在本研究中PCA组血清TPSA均 > 4 ng/mL，BPH组中有34.18%(27/79例)的患者显示TSPA> 4 ng/mL;PCA组中有15.09%(8/53例)的患者TSPA < 10 ng/mL，BPH组中13.92%(11/79例)患者TPSA > 10 ng/mL。本研究中均为行手术治疗且病理确诊患者，均有重度下尿路梗阻症状或出现过尿潴留情况，导致整体PSA水平偏高而不具代表性，同样因PCA患者Gleason评分几乎均在7分以上而未能行PSM-E表达与Gleason评分相关性分析。既往的研究只证明血清PSA水平越高，前列腺癌的可能性越大，当PSA < 4 ng/mL时，大约有20%的假阴性患者漏诊;传统的临界值(4 ng/mL)只能使大约25%PCa被早期察觉，只有当PSA > 10 ng/mL时，诊断PCA的阳性率才能提高到50% ～ 70%。我们同样发现当设定不同的检测低限值时，两组患者中PSM-E和PSMA的阳性检出率有很大的不同，当以10-6为检出低限时，PCA组中PSMA检出阳性率为45.28%(24/53例)，PSM-E为69.81%(37/53例)，BPH组中PSMA检出阳性率为21.52%(17/79例)，PSM-E为45.57%(36/79例);当以10-5为检出低限时，PCA组中PSMA的阳性检出率为20.75%(11/53例)，PSM-E为66.04%(35/53例);BPH组中PSMA的阳性检出率为7.59%(6/79例)，PSM-E的检出率为36.71%(29/79例)。可以发现当检测低限提高至10-6和10-5时，PSM-E对PCA患者仍有很高的阳性检出率且显著高出PSMA的阳性检出率，而对BPH患者的阳性检出率两者均明显下降。我们对PSM-E和PSMA数据进行ROC曲线分析，结果表明与PSMA相比较PSM-E曲线更贴近sensitivity和上面的横轴，PSM-E曲线下面积要大于PSMA，本研究中对PCA及BPH患者研究数据分析表明PSM-E在诊断PCA的敏感性、特异性方面要优于PSMA。

　　3.3 小 结

　　我们的研究结果表明，外周血中PSM-E表达在PCA及BPH患者间存在差异，通过高灵敏检测手段可用于区分两类患者，PSM-E外周血检测灵敏度高于PSMA，PSM-E在诊断PCA的敏感性和特异性方面要优于PSMA，PSM-E外周血检测有望成为前列腺癌的新的特异性诊断指标。后续研究中将进一步扩大例数及完整设计，以具体评定PSM-E外周血检测的诊断标准，探讨其替代及联合PSA检测诊断PCA的可能及意义。

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