Survivin基因与NET-1蛋白在膀胱癌中的表达及相互关系

　　作者：王平**，董德平***，陈莉，张剑平，卫爱军，曹斌 作者单位：南通大学附属海安医院，海安226600

　　【摘要】 目的:探讨survivin基因和NET-1蛋白在膀胱癌中的表达及其与临床病理特征的关系。方法:采用逆转录聚合酶链反应和免疫组化方法分别检测27例膀胱癌组织和10例正常膀胱组织survivin基因和NET-1蛋白的表达，并将结果进行相关分析。结果:27例膀胱癌组织中survivin基因阳性17例(62.96%)，NET-1蛋白阳性21例(77.78%);10例正常膀胱组织未见survivin基因表达，NET-1蛋白表达10.00%(1/10),二者差异有统计学意义(P<0.01);survivin基因与NET-1蛋白表达有相关性(χ2=7.09，P<0.01)，survivin基因和NET-1蛋白表达与膀胱癌WHO分级和TNM分期有关，与患者年龄和性别无关。结论:survivin基因和NET-1蛋白在膀胱癌中过度表达表明膀胱癌发生、发展与细胞凋亡和细胞增殖有关，survivin基因对膀胱癌早期诊断和靶向治疗有重要意义。

　　【关键词】 膀胱癌;survivin基因;NET-1蛋白;逆转录聚合酶链反应;免疫组化

　　Survivin是近年来发现的一种新的凋亡抑制因子，属于凋亡抑制蛋白(IAP)家族的新成员，主要通过抑制 caspase-3 和caspase-7的活性而抑制细胞凋亡过程，NET-1是新发现的细胞增殖因子，参与了肿瘤细胞的增殖。我们采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组化方法分别检测2000年1月~2005年1月间我院收治膀胱癌患者27例癌组织中survivin mRNA和 NET-1蛋白表达情况，探讨两者的关系以及与膀胱癌临床病理关系，现报告如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 组织来源 膀胱癌27例术前均未经放疗和化疗，新鲜组织(距癌边缘2cm)离体后分2份，1份石蜡包埋，1份由液氮转运置于-70℃冰箱内保存备用。所有标本病史资料完整，均经临床、病理确诊，其中男19例，女8例，年龄31~87岁，平均59岁，均为初次手术。按WHO病理分级Ⅰ级8例，Ⅱ级12例，Ⅲ级7例;按TNM分期T1 6例，T2 10例，T3 5例，T4 6例，病理诊断为膀胱移行上皮细胞癌，且均获门诊随访，时间为6个月~5年。对照组10例膀胱正常组织由南通大学法医教研室提供，均经病理证实。

　　1.1.2 试剂和仪器 Trizol为美国Invitrogen公司产品;RT-PCR试剂盒为荷兰QIAGEN公司产品;DNA Marker DL 2000购自日本TaKaRa公司;Taq DNA聚合酶与PCR 10×Buffer购自上海生工生物技术工程有限公司;PCR仪为美国MJ Research公司产品;凝胶图像分析系统为上海四新生物技术有限公司产品;核酸和蛋白质含量测定仪为德国Eppendorf公司产品。

　　1.1.3 引物合成 Survivin的上游引物序列为：5′-CAAGGACCACCGCATCTC-3′，下游引物为：5′-TTCTCCGCAGTTTCCTCAA-3′，扩增目的基因产物长度为348bp。采用GAPDH为内参照。

　　1.2 方法

　　1.2.1 组织总RNA的提取 100mg膀胱癌组织置于玻璃匀浆器中，加入Trizol试剂1ml匀浆后置室温5min，加入氯仿0.2ml，于4℃ 12000g/min离心15min，取上清，加异丙醇0.5ml 15min后于4℃、12000g离心15min，取沉淀溶于无RNA酶的去离子水中用于RT-PCR扩增， 抽提出的RNA经凝胶电泳鉴定RNA质量，OD260/280鉴定RNA的纯度。

　　1.2.2 cDNA合成 在无RNA酶的离心管中加入RNA 2μl (含总RNA 2μg)，依次加入10×Buffer 2.0μl; 5mmol/L dNTPmix 2.0μl;Oligo-dT引物1.0μl;Omniscript Reverse Transcriptase 1.0μl;RNase-free水10.0μl; 总体积20μl 置于37℃孵育60min。然后加入20μl DEPC水终止反应，-20℃保存备用。

　　1.2.3 聚合酶链式反应 在0.5ml PCR管中，依次加入下列试剂：cDNA 2μl，survivin上下游引物(10μmol/L)各1μl，GAPDH上下游引物(10μmol/L)1μl，dNTPmix(2mmol/L)1μl, 10×PCR Buffer 2.5μl, MgCl2(2mmol/L ) 1.5μl, TaqDNA聚合酶0.25μl，总体积为25μl。反应在微量离心管中进行,将反应管置于PCR仪中扩增，参数设置如下：94℃预变性3min，94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，进行35个周期的循环反应, 最后72℃延伸7min。survivin和GAPDH反应条件相同。

　　1.2.4 PCR扩增产物电泳鉴定和半定量分析 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果，并采用凝胶图像分析系统进行扫描，以survivin带亮度(Ls)、GAPDH带亮度(Lγ)分别与背景亮度(Lb)的差值之比计算每例survivin的相对表达量,即survivin的相对表达量=(Ls-Lb)/(Lγ- Lb)。

　　1.2.5 NET-1蛋白检测 NET-1蛋白采用免疫组化法(SP法)，染色阳性呈棕黄色或棕褐色颗粒，主要定位于胞质或胞膜。

　　1.3 统计学方法 survivin相对表达量以■±s表示，采用t检验或方差分析，计数资料采用χ2检验，P<0.05表明差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 膀胱癌和正常组织survivin基因和NET-1蛋白表达 survivin基因经RT-PCR扩增产物为348bp，GAPDH内参照为250bp(图1)。27例膀胱癌组织中survivin基因阳性表达17例(62.96%)，NET-1蛋白表达定位于胞质(图2)， 阳性表达21例(77.78%);10例正常膀胱组织未见survivin基因表达、而NET-1蛋白表达1例(10.00%)，两组间差异有统计学意义(P<0.01)。

　　2.2 膀胱癌中survivin基因和NET-1蛋白表达与临床病理特征的关系 见表1。

　　2.3 膀胱癌组织中survivin基因表达与NET-1蛋白表达的关系 NET-1蛋白在膀胱癌中表达21例(77.78%)，在NET-1蛋白阳性表达组中，survivin基因表达16例(76.19%)，NET-1蛋白阴性组中survivin基因表达1例(16.67%)，NET-1蛋白表达与survivin基因表达有显著相关性(χ2=7.09，P<0.01)。

　　3 讨论

　　1997年耶鲁大学的Ambrosini等用效应细胞蛋白酶受体1(EPR-1)cDNA在人类基因组文库中筛选克隆出survivin基因，定位于17q25。研究表明，survivin可表达于大多数肿瘤细胞中，但在终末分化组织中一般不表达或低表达[2]。本文膀胱癌组织和正常膀胱组织中survivin mRNA基因阳性率分别为62.96%和0.00%，说明survivin基因参与了膀胱癌的发生、发展，机制可能是survivin通过抑制细胞调亡信号使肿瘤细胞逃避机体免疫系统监视而无法清除，延长了肿瘤细胞生存期，从而有利于膀胱癌的发生、发展。如果利用survivin基因进行靶向治疗可提高膀胱癌的临床疗效。

　　NET-1是最新报道的肿瘤相关分子基因[3]，定位于1p34.1，NET-1与NET-2、NET-3、NET-4、NET-5、NET-6和NET-7总称为NET-X，属于四聚体超家族(TM4SF)的成员之一，NET-1基因可表达于人类多种细胞株中，如肝癌、胃肠道癌、宫颈癌肿瘤等组织中，可能传导细胞分裂的信号和(或)引起细胞异向分化或去分化，与肿瘤细胞增殖有关。有报道NET-1基因特异性地存在于人类前列腺组织中，由于正常、良恶性前列腺肿瘤中均可检测到NET-1基因，所以NET-1基因在前列腺组织中无诊断价值[4]， Serru等[5]用RT-PCR在人类不同的细胞株中筛选到NET-1基因表达，如宫颈癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌细胞株中。本研究通过我们制备的NET-1基因抗体采用免疫组化的方法观察了NET-1在膀胱癌中定位及表达，结果显示NET-1主要定位于膀胱肿瘤细胞胞浆内和胞膜上，其表达率为77.78%，且随着病理分级和临床分期的增高表达率有升高的趋势，说明NET-1作为一种膜蛋白和胞浆蛋白可能传导细胞分裂信号和引起细胞异向分化，从而上调膀胱癌恶性进展。由于NET-1在膀胱癌中高表达，提示有可能采用NET-1基因反义序列注入肿瘤内抵消NET-1基因的促增殖作用，达到基因治疗的目的。

　　Survivin基因和NET-1蛋白在膀胱癌细胞中高表达且两者随膀胱癌的恶性程度增加而增大，说明survivin 基因可能通过抑制膀胱癌细胞的凋亡过程及与NET-1蛋白的增殖协同作用，对膀胱癌的发生、发展起重要作用，对膀胱癌的早期诊断和临床靶向治疗具有重要作用。

　　【参考文献】

　　[1] 张辉芳，樊绮诗.抗凋亡蛋白生存素与肿瘤的关系及检测[J].中华检验医学杂志，2003，26(12)∶797.

　　[2] Sakamoto Y, Mafune K, Mon M, et al. Overexpression of MMP-9 correlates with growth of small hepatocellular carcinoma[J]. Int Oncol, 2000,17(2)∶237.

　　[3] Xu J，Stolk JA，Zhang X，et a1.Identification of differentially expressed genes in human prostate cancer using subtraction and microarray[J].Cancer Res，2000，60(6)∶1677.

　　[4] Serru V, Dessen P, Boucheix C, et al. Sequence and expression of seven new tetraspan[J]. Biochim Biophs Acta,2000,1478(1)∶159.