超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A基因克隆与鉴定

　　作者：郝林，韩从辉，王跃闽，贡震，董秉政，胡建鹏 作者单位：1.徐州市中心医院泌尿外科，江苏徐州;2.上海同济大学附属东方医院泌尿外科，上海

　　【摘要】 目的 克隆金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)全长基因并构建其表达载体。方法 采用PCR技术,从产SEA的葡萄球菌标准菌株ATCC13565基因组DNA中获得SEA全长序列共771 bp,克隆入pUC57载体中,进行酶切及测序鉴定。结果 克隆了SEA全长基因，经测序证实与Genbank中收录的SEA基因序列完全一致。结论 本研究成功地克隆了SEA全长基因,为进一步研究SEA基因的靶向抗肿瘤研究奠定了实验基础。

　　【关键词】 金黄色葡萄球菌;肠毒素;克隆;序列分析

　　Cloning and identification of the gene encoding the superantigen

　　staphylococcus enterotoxin A

　　HAO Lin1, HAN Conghui1*, WANG Yuemin2, GONG Zhen1, DONG Bingzheng1, HU Jianpeng1

　　(1.Department of Urology, Xuzhou Central Hospital, Xuzhou, Jiangsu 221009, China;

　　2.Department of Urology, Affiliated East Hospital, Tongji University, Shanghai 200120)

　　Abstract: Objective To clone the full-length gene of staphylococcal enterotoxin A (SEA) and construct its expression vector. Methods The technique of polymerase chain reaction (PCR) was employed to obtain 771bp full-length sequence of SEA from the gene group DNA of standard strain ATCC13565. The SEA gene was amplified and inserted into cloning vector pUC57. The structure of recombinant pUC57-SEA plasmid was confirmed by restriction endonuclease and sequence analysis. Results The 771 bp DNA sequencing showed that the DNA sequence of the cloned gene was identical to the data recorded in Genbank Database. Conclusion This study has successfully amplified and cloned the full-length gene encoding SEA toxin and established a basis for the SEA gene target for antitumor research.

　　Key words: staphylococcus aureus; enterotoxin; clone; sequence analysis

　　超抗原(superantigen，SAg)是一组细菌或病毒编码的蛋白质分子，可不需要抗原提呈细胞(antigen-presenting cell, APC)的提呈作用，以完整的蛋白质分子形式直接与APC膜的MHC-Ⅱ类分子抗原结合槽外侧结合并且提呈给T细胞[1]。SAg-MHC-Ⅱ类分子复合物仅与T细胞抗原受体(TCR)β链的V区相结合[2]，由于人类Vβ基因有20余种，故SAg激活的T细胞克隆数可达普通抗原的数千倍乃至数万倍。超抗原的抗肿瘤作用主要是由SAg依赖的细胞介导的细胞毒作用(superantigen-dependented cellular totoxicity, SDCC)来完成，这是超抗原抗肿瘤的主要作用。再者，SAg激活的CD4+T细胞还可以分泌多种足量的细胞因子，如：肿瘤坏死因子(TNF)-α、TNF-β和INF-γ、白细胞介素(IL)-2、IL-6等[3]，直接或间接地杀伤肿瘤细胞。本研究克隆超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)全长基因，为进一步研究超抗原SEA基因片段在抗肿瘤中的作用提供实验基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 产SEA金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC13565购自中国药品生物制品检定所,大肠埃希菌JM109和质粒pUC57为Sangon公司产品。T4DNA连接酶、Taq DNA聚合酶和限制性内切酶EcoR V、KpnI、HindⅢ均购自Takara公司,质粒小量提取试剂盒购自Invitrogen公司，其余试剂均为分析纯。

　　1.2 SEA基因的PCR扩增 以产SEA的金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC13565为模板,进行PCR扩增,根据GenBank已知的SEA基因序列设计一对引物：上游引物为5′-CCAATATGAAAAAAACAGCAT-3′,其中CCAAT为保护性碱基;下游引物为5′-ATTGGACTTGTATATAAATATATA-3′，其中ATTGG为保护性碱基。引物由南京金思特科技有限公司合成。PCR循环参数为94℃预变性4 min,94℃ 变性30 s,56℃退火1 min,72℃延伸1 min,进行35个循环,最后72℃延伸7 min,扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

　　1.3 PCR产物连接入pUC57载体 用EcoR V酶切pUC57质粒，将目的基因的PCR产物与pUC57载体酶切产物进行连接，16℃反应过夜。转化JM109感受态细胞，涂氨苄抗性平板，37℃过夜培养，筛选克隆，提取质粒电泳及KpnI、HindⅢ双酶切鉴定，并测序确认插入产物。

　　1.4 重组质粒的测序 由南京金思特科技有限公司进行。

　　2 结 果

　　2.1 SEA基因的扩增 产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析,于771 bp处有1条特异扩增条带。见图1。

　　2.2 重组质粒pUC57-SEA的构建和鉴定 将重组质粒进行KpnI、HindⅢ双酶切鉴定，结果表明已成功获得pUC57-SEA重组质粒(图2)。DNA序列分析与GenBank已知SEA基因序列相一致(图3)。

　　3 讨 论

　　我们在以往的试验中研究了SEA体外刺激T细胞后CTL的增殖情况和抗肿瘤效应，SEA活化的CTL细胞对E-J膀胱肿瘤细胞在体外产生强大的杀伤作用。同时我们通过动物实验观察SEA活体应用的抗瘤效果，结果显示SEA对活体肿瘤的生长有良好的抑制性，抑瘤率达84.7%[4]。

　　但是单用超抗原治疗的缺陷也是非常明显的，即超抗原介导的CTL主要杀伤MHC-Ⅱ阳性的肿瘤细胞，对MHC-Ⅱ阴性的肿瘤细胞杀伤作用较弱，但肿瘤细胞MHC-Ⅱ阳性率一般都很低，并具有明显的异质性。因此，单纯的超抗原抗肿瘤效果不理想，且难以避免对机体MHC-Ⅱ阳性的正常细胞造成的毒副作用。为了使超抗原能定位于肿瘤局部激活大量免疫效应细胞，有学者尝试进行超抗原的基因治疗，构建了超抗原SEA、SEB、TSST1的真核表达载体，转染小鼠B16黑色素瘤细胞、人SK38黑色素瘤细胞以及犬黑色素瘤活检培养得到的细胞，使之在胞内和胞外都得到表达。实验显示转染细胞产生的超抗原保持了与TCR结合的能力，并有效使细胞表达超抗原蛋白，引发局部强烈的T细胞炎症反应。表明在肿瘤内直接转染超抗原基因可诱导肿瘤局部和全身的抗肿瘤免疫应答，从而有效控制肿瘤生长[5]。

　　本实验应用基因重组技术，以产 SEA的葡萄球菌标准菌株ATCC13565为模板，进行PCR扩增，获得SEA全长基因组DNA序列共771 bp。通过酶切、纯化、连接等重组方法，构建带有目的基因片段的克隆载体pUC57-SEA。PCR产物和酶切产物经电泳鉴定，可以在凝胶板上看到在771 bp位置有1条DNA条带。经测序验证，此DNA片段与GenBank已知SEA基因序列相一致。本研究结果为进一步研究SEA基因对肿瘤的杀伤作用提供了前提条件。

　　【参考文献】

　　[1] 郝林,贡震，韩从辉.超抗原靶向抗肿瘤研究进展[J].国际肿瘤学杂志，2008，35(7)：486-488.

　　[2] Pumphrey N, Vuidepot A, Jakobsen B, et al. Cutting edge: Evidence of direct TCR alpha-chain interaction with superantigen [J]. J Immunol,2007，179(9):2700-2704.

　　[3] Bode U, Lrchner M, Pabst R, et al. The superantigen-induced polarization of T cells in rat peripheral lymph nodes is influenced by genetic polymorphisms in the IL-4 and IL-6 gene clusters [J]. Int Immunol,2007,19(1):81-92.

　　[4] 韩从辉，田军，郑宝钟，等.超抗原诱导杀伤性T细胞体内外对膀胱肿瘤的杀伤作用研究[J].中华肿瘤杂志，2000，22(5): 392-392.

　　[5] Si S, Sun Y, Li Z, et al. Gene therapy by membrane-expressed superantigen for alpha-fetoprotein-producing hepatocellular carcinoma [J]. Gene Ther,2006,13(22):1603-1610.