VEGF／KDR双位点抑制诱导膀胱癌细胞凋亡和丝裂霉素C化疗增效的实验研究

　　作者：刘禄成 韩艳君 魏巍 李然伟 王颂 作者单位：吉林大学第二医院泌尿外科，吉林 长春 130041

　　【摘要】 目的 观察针对VEGF/KDR双位点抑制诱导膀胱癌T24细胞凋亡以及对联合应用细胞毒药物丝裂霉素C(MMC)的增效作用。方法 将针对血管内皮生长因子(VEGF)的VEGFsiRNA和VEGF受体2(KDR)的可溶性受体(sKDR)表达质粒共转染T24细胞和在其中加入MMC的细胞悬液分别汁射到裸鼠背部皮下，观察两者对裸鼠膀胱痛生长的影响。结果 两种制剂均能在不同程度上诱导膀胱癌细胞凋亡，抑制癌细胞增殖，从而延缓甚至遏制肿瘤生长。但加入MMC组作用更显著，效果更好，两组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 VEGFsiRNA和sKDR通过双重途径有效抑制VEGF的生物活性，使其促肿瘤血管生成的能力明显降低，诱导细胞凋亡的作用显著提高。在辅以MMC后这种作用效果进一步加强。因此推测，抗VEGF/KDR基因的双位点靶向治疗与肿瘤化疗的结合可能是一个具有诱人前景和巨人潜力的膀胱癌治疗方案。

　　【关键词】 膀胱肿瘤;受体，血管内皮生长因子;丝裂霉素C

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目(30571857)

　　Experimental study of VEGF/KDR double sites inhibition induced apoptosis in bladder carcinoma and the increased chemotherapy effect of mitomycin C

　　LIU Lu-Cheng, HAN Yan-Jun, WEI Wei, et al.

　　Urinary Surgery of Second Hospital, Jilin University, Changchun 130041, Jilin, China

　　【Abstract】 Objective To observe the effect of VEGF/KDR double sites inhibition induced T24 apoptosis and increased chemotherapeutic effect with cytotoxic drug mitomycin C (MMC).Methods Cell suspension of T24 cells transfected with soluble KDR (sKDR) of VEGF siRNA and VEGF receptor 2 (KDR) and cell suspension added with MMC were subcutaneouly injected into athymic mouse back to observe their effect on angiogenesis in bladder carcinoma. Results Two preparations induced apoptosis in bladder carcinoma and inhibited carcinoma cellular proliferation to postpone, even to limit carcinoma growth. There was better effect in MMC group than that in control group (P<0.05). Conclusions VEGFsiRNA and sKDR could inhibit angiogenesis and induce apoptosis in bladder carcinoma by suppressing actively bioactivity of VEGF through double pathways, being strengthened by adding MMC. The combination of anti-VEGF/KDR gene targets therapy and chemotherapy might be a therapeutic regimen of bladder carcinoma for its temptation perspective and great potential.

　　【Key words】 Bladder carcinoma;Receptor，vascular endothelial growth factor;Mitomycin C

　　近年来血管内皮生长因子(VEGF)及其受体2(kfinase insert domain-containing receptor，KDR)为靶点的肿瘤血管靶向治疗最受推祟，被普遍认为是极具发展潜力和有广阔应用前景的种崭新的抗癌策略〔1～3〕。以VEGF和KDR为靶点的肿瘤血管生成抑制剂具有特异性高，不易产生耐药和副作用小等优点，成为近年来抗肿瘤药物研究与开发的热点。随之而来它和具有细胞毒作用的化疗药物联合应用是否有协同增效作用的研究亦引发了人们极大的兴趣〔4〕，但有关这方面的研究在膀胱肿瘤中却鲜有报道。本实验旨在通过对VEGF和KDR靶向治疗与肿瘤化疗结合的研究为临床膀胱癌的治疗提供依据和另辟新径。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 实验动物为6周龄雄性裸鼠30只，平均体重20 g(吉林大学白求恩医学部实验动物中心);人膀胱癌细胞株T24(中国科学院上海细胞所);MMC(日本协和药业公司);VEGFsiRNA和sKDR表达质粒的转染T24细胞株由本实验室构建并传代保存。

　　1.2 方法 ①将30只裸鼠随机分为3组，即对照组，单独用药组和联合用药组，每组10只，分别在每只裸鼠背部皮下注射1 ml未经处理和经过处理的T24细胞悬液，从第7 d开始测量成瘤裸鼠的肿瘤大小。根据肿瘤长径(L)和短径(W)，按照公式V=L×W2×0.523 6计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线并计算成瘤率。5周后颈椎脱臼处死成瘤裸鼠，迅速剪开皮肤，完整剥离肿瘤块，10%甲醛固定，石蜡包埋备用。②移植瘤组织VEGF及TOFOⅡα增殖指数的测定：裸鼠肿瘤组织石蜡包埋后4 μm连续切片，微波炉法修复抗原，与VEGF单抗(ABCAM)、TOPOⅡα多抗(neomarker)4℃孵育过夜，滴加生物素化二抗37℃作用20 min，再滴加SABE试剂(Sigma)，DAB作为底物观察显色。分别用已知VEGF及TOFOⅡα表达阳性的裸鼠膀胱癌标本作阳性对照，非免疫血清代替一抗作阴性对照。结果判定：VEGF阳性时细胞浆或胞膜出现棕黄或棕褐色颗粒。每张切片随机取5个视野，用MPTAS-500多媒体彩色病理图文分析系统对阳性细胞着色平均灰度定量测定。平均灰度值与VEGF表达呈反比，平均灰度值越大，VEGF表达水平越低;TOPOⅡα阳性细胞位于细胞核，呈棕黄色，每张切片观察5个视野，每个视野连续数200个细胞，计数阳性细胞百分比即增殖指数。③TUNEL法检测移植瘤细胞凋亡：石蜡切片经脱蜡、脱水后蛋白酶K 37℃消化30 min;PBS洗片3次，每次5 min;滴加TUNEL反应液100 μl，37℃湿盒孵育1 h;PBS洗片3次，每次5 min;滴加过氧化物酶标记的抗荧光素抗体，37℃湿盒孵育30 min;直接滴加新鲜配制DAB溶液，室温显色3～6 min;自来水充分冲洗，脱水透明，封片，显微镜下观察并拍照。以PBS替代TUNEL反应液作阴性对照，阳性对照片经DNase I预处理(部分降解DNA)10 min，再按TUNEL步骤进行染色。结果判定：阳性反应物质呈棕黄色，主要位于细胞核内。细胞核染为棕黄色的为凋亡细胞，每张切片观察5个视野，每个视野连续数200个细胞，计数凋亡细胞百分比即凋亡指数。

　　1.3 统计学处理 实验数据用x±s表示，t检验进行组间均数分析比较。

　　2 结果

　　2.1 VEGF siRNA/sKDR联合MMC对T24细胞移植瘤生长的影响：T24细胞接种裸鼠背部皮下后经过7～10 d的成瘤潜伏期时在其接种部位形成肉眼可见的肿瘤结节。对照组，VEGF siRNA/sKDR组及联合MMC组的成瘤率分别为10/10、6/10、3/10。每7 d对肿瘤体积进行检测，结果见图1。VEGF siRNA/sKDR单独或联合MMC均可对肿瘤生长产生不同程度的抑制作用，但联合组肿瘤体积从第14天开始变小，在18 d后肿瘤生长几乎处于停滞状态。

　　图1 VEGF siRNA/sKDR双位点抑制+MMC对T24细胞裸鼠移植瘤生长的影响(略)

　　2.2 VEGF/KDR双位点抑制联合MMC对转移瘤VEGF表达的影响 对裸鼠移植瘤组织VEGF表达检测结果见图2。VEGF siRNA/sKDR无论是单独应用还是联合MMC治疗均可明显抑制肿瘤细胞VEGF表达，但联合应用时效果更为显著(P<0.000 1)。

　　图2 裸鼠移植瘤VEGF表达的免疫组化分析×200(略)

　　2.3 VEGF/KDR双位点抑制联合MMC对肿瘤细胞增殖及凋亡的影响 图3为荷瘤裸鼠肿瘤组织TOPOⅡα免疫染色结果，图4为肿瘤细胞凋亡分析结果，TOPOⅡα增殖指数及凋亡指数分析结果见表1。两组比较，VEGF siRNA/sKDR无论单独或联合MMC均可有效降低肿瘤细胞增殖比例(P<0.000 1)，显著增加凋亡细胞数(P<0.000 1)。但与单独治疗组相比联合应用组对细胞凋亡的诱导程度更大(P<0.05)。

　　图3 裸鼠移植瘤细胞增殖分析(TOPOⅡα免疫组化结果)×200(略)

　　图4 裸鼠移植瘤细胞凋亡分析(TUNEL)×200(略)

　　表1 VEGF siRNA/sKDR双位点抑制+MMC对裸鼠移植瘤增殖及凋亡的影响(略)

　　与对照组比较：1)P<0.000 1;与2)VEGF siRNA/sKDR组比较：P<0.05

　　3 讨论

　　与传统治疗方法比较，以癌基因为靶点的抗肿瘤血管治疗有诸多优点，大量的研究显示了良好的应用前景，但仍存在着固有的缺陷〔5〕。这是因为肿瘤的体积小于2～3 mm3时肿瘤细胞可直接从组织间液获得足够的营养面对血管依赖性不大。因此抗肿瘤血管治疗对3 mm3以下的肿瘤无效。然而包括丝裂霉素在内的大多数化疗药物则能通过诱导细胞凋亡来抑制肿瘤的发生发展〔6〕。本实验结果表明上述两种抗肿瘤策略均有效，但将两种策略联合应用时效果更佳。提示以VEGF/KDR双位点为靶的抗肿瘤血管基因治疗结合诱导肿瘤细胞凋亡的细胞毒药物化疗的治疗方案更理想，它有可能完全替代目前的肿瘤治疗模式，从而成为新的有效方法并将为包括膀胱癌在内的其他肿瘤治疗带来突破性进展。

　　本实验结果显示，人膀胱癌T24细胞在裸鼠背部皮下的成瘤率分别是：对照组10/10(100%);VEGF siRNA/sKDR处理组6/10(60%);VEGF siRNA/sKDR+MMC组3/10(30%)。这说明针对VEGF的VEGF siRNA和VEGF受体2(KDR)的sKDR对膀胱癌治疗的有效性，也进一步证明了VEGF和KDR在膀胱癌的发生发展中扮演着十分重要的角色，抑制VEGF和KDR表达确能延缓甚至遏制膀胱癌的生长。而在此基础上联合应用MMC化疗则能显著提高通过抗血管生成治疗肿瘤的治疗效果。

　　【参考文献】

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　　5 Capriotfi T.New oncology strategy：molecular targeting of cancer cells〔J〕：Medsurg Nurs，2004;13(3)：191-5.

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