雄激素对小鼠前列腺细胞增殖凋亡及相关增殖因子的影响

　　作者：贾彬 黎玮 剧亚崇 蔡文清 作者单位：河北医科大学法医学系，河北 石家庄 050017

　　【摘要】 目的 探讨外源性雄激素对小鼠前列腺细胞增殖凋亡及部分相关生长因子表达的影响，了解雄激素在前列腺生长发育中的作用。方法 对20例睾酮处理的，以及20例空白对照昆明种雄鼠前列腺标本，采用流式细胞术检测细胞增殖指数、凋亡率及表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达水平。结果 经雄激素处理后，小鼠前列腺细胞增殖指数明显升高(P<0.01)，凋亡率明显降低(P<0.01)，EGF标记率和表达水平显著升高(P<0.01)，bFGF标记率和表达水平也明显升高(P<0.05)。结论 雄激素可促进前列腺细胞增殖、凋亡的严重失衡以及促增生生长因子的高表达是导致小鼠前列腺增生的重要原因。

　　【关键词】 前列腺增生;雄激素;增殖与凋亡：生长因子

　　关于雄激素在前列腺增生中作用已得到共识，认为前列腺的正常发育有赖于雄性激素，改变雌雄激素的比例可诱发前列腺的增生，在培养的前列腺细胞中加入雄激素可使生长因子的表达增加，使用抗雄激素类药物可治疗前列腺增生并与抗凋亡基因表达有关〔1～3〕。但雄激素是如何使前列腺发生增生，机制尚不完全清楚。本研究从前列腺细胞增殖、凋亡和生长因子的表达等方面探讨了雄激素对前列腺增生的作用机制，为临床治疗良性前列腺增生(BPH)提供依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物及分组

　　由河北医科大学实验动物中心饲养的雄性昆明小鼠40只(合格证号：医动字第04056)，鼠龄为出生后22～27(平均24.2) d，体重15～20(平均16.4) g。 随机分为实验组和对照组，每组20只。

　　1.2 给药方法

　　实验组小鼠：皮下注射麻油稀释后的睾酮0.02 mg·只-1·d-1，连续给药至第28天断颈处死，剖腹取前列腺称重后70%乙醇固定，4℃冰箱冷藏备用;对照组小鼠：皮下注射等量麻油其余处理与实验组相同。

　　1.3 FCM单细胞样品制备

　　采用搓网法。将70%酒精固定的标本用生理盐水冲洗后，将组织剪碎，放在搓网上用眼科镊子轻轻搓组织，边搓边用盐水冲洗，直至将组织搓完，收集细胞悬液，500～800 r/min离心2 min，用生理盐水离心洗涤2次，置0～4℃冰箱待测。

　　1.4 增殖和凋亡的FCM荧光检测样品制备

　　采用碘化丙啶一步DNA荧光染色法〔4〕。

　　1.5 EGF、bFGF的FCM免疫荧光检测样品制备

　　采用间接免疫荧光标记法，取1×106/ml细胞，用PBS液洗涤2次，每次1 000 r/min离心2 min，去上清液，加入1∶100的鼠抗人单抗(EGF)或1∶50兔抗人多抗(bFGF)，在37℃水浴中温育30 min，用PBS洗涤2次，离心弃上清，加入1∶100稀释的羊抗鼠(或羊抗兔)FITCIgG 100 μl，37℃温育30 min，洗涤2次，离心弃上清，除去未结合的多余荧光抗体，上机检测前加入1.0 ml PBS液，经400目筛网过滤，即上机分析。同时设有：①PBS代替一抗的阴性对照;②只加一抗的阳性对照;③只加1∶100FITCIgG(二抗)的阳性对照;④小鼠血清或兔血清的同型对照。

　　1.6 免疫荧光及碘化丙啶荧光的FCM检测

　　应用FACS420型流式细胞仪进行。测定前以鸡红细胞作为标准样品调整仪器的CV值在5%以内。数据采集均采用线性方式。数据和图像送入HP300 Cpmsprt 30计算机，应用相应的程序软件进行资料处理，计算标记率(%表示)和表达水平(以荧光指数FI值表示相对含量)，以增殖指数表示细胞增殖情况，以DNA亚二倍体峰计算凋亡率。

　　1.7 统计学处理

　　所有数据均以x±s表示，采用state软件两个样本的t检验。

　　2 结 果

　　2.1 前列腺湿重的变化

　　实验组小鼠前列腺湿重(45.67±2.79)mg，对照组小鼠前列腺湿重(20.40±4.96)mg，实验组前列腺湿重显著高于对照组(P<0.01)。表1 雄激素对前列腺细胞增殖、凋亡、EGF和bFGF因子表达的影响(略)

　　2.2 前列腺细胞增殖、凋亡，EGF、bFGF表达水平的变化

　　如表1所示，经雄激素处理后，实验组小鼠前列腺细胞增殖指数明显高于对照组(P<0.01)。凋亡率明显降低对照组(P<0.01)。EGF、bFGF的表达，EGF的表达实验组标记率和表达水平显著高于对照组(P<0.01)。bFGF的表达，实验组标记率和表达水平明显升高(P<0.05，P<0.01)。

　　3 讨 论

　　前列腺的正常生长依赖于雌、雄激素间的平衡，同时促增生生长因子与抑制增生生长因子，以及引起前列腺细胞增殖与凋亡。正常情况下，这两种调控机制相对平衡，无论增殖增加、或者是凋亡的减少，都可引起前列腺的增生。任何组织的生长和退化都要保持细胞增殖和凋亡间的相对平衡，以维持器官体积功能的稳定，一旦平衡失调，就可能导致疾病的出现。本实验中，引起小鼠前列腺增生重要原因之一是由于增殖与凋亡失衡。蔡文清〔5〕等认为前列腺移行区细胞的增殖率升高是发生前列腺增生的关键。Claus〔6〕等研究显示，在BPH的发生过程中，早期上皮细胞和间质细胞均过度增生，而前列腺体积的增大则主要是间质细胞的凋亡减少所致，并认为其机制是由于雄激素对凋亡的抑制增强所致，也就是说，雄激素在某种程度上可以影响凋亡率的表达。

　　许多研究都认为BPH的发生与生长因子的局部作用密切相关。EGF是一种分子量为6 000，有53个氨基酸残基的细胞调节多肽，在前列腺的功能可能是调节平滑肌收缩;促进细胞增殖;维持前列腺增生的稳定和膜离子的流动〔7〕。bFGF为146个氨基酸的蛋白质，是一种有效的间质细胞有丝分裂原和血管生成因子，也是BPH发生中间质一上皮相互作用的重要调节因子，在前列腺基底上皮细胞的胞浆内有很强的表达〔8〕。前列腺内的生长因子及其受体的产生，一个共同的特点就是受雄激素的调控。大量实验表明前列腺的生长发育依赖于雄性激素存在，主要通过调控生长因子的表达来实现，同时，雄激素和生长因子协同作用可大大增加前列腺特异性抗原的表达水平〔9〕。Pollan〔10〕等报道给予一定的雄激素可诱发大鼠幼年时期前列腺增生，在大鼠前列腺基质细胞和表皮细胞有明显的高表达，而这两种生长因子对雄激素的调控很敏感。

　　本实验应用外源性雄激素后，小鼠前列腺细胞凋亡率明显下降，而增殖率明显升高，增殖与凋亡间的平衡被打破，并且促增生生长因子EGF和bFGF的表达明显升高。故表明外源性雄激素是通过引起增殖、凋亡的严重失衡以及促增生生长因子的高表达导致小鼠前列腺增生〔11〕。

　　【参考文献】

　　1 Saez C，GonzalezBaena AC，Japon MA，et al.Expression of basic fibroblast growth factor and its receptors FGFRI and FGFR2 in human benign prostatic hyperplasia treated with finasteride〔J〕.Prostate，1999;40(2)：838.

　　2 Nakano K，Fukabori Y，Itoh N，et al.Androgenstimulated human prostate epithelial growth mediated by stromalderived fibroblast growth factor10〔J〕.Endocr J，1999;46(3)：40513.

　　3 贾 彬，蔡文清，黎 玮，等.雌激素对前列腺增生症移行区细胞Bcl2、Bax和cmyc基因表达的影响〔J〕.中华实验外科杂志，2004;21(1)：778.

　　4 左连富.流式细胞术样品制备技术〔M〕.北京：华夏出版社，1991：4951.

　　5 蔡文清，凌亦凌，黎 玮，等.前列腺增生症各区细胞增殖与凋亡特征的研究〔J〕.中华泌尿外科杂志，2000;21(4)：2236.

　　6 Claus S，Berges R，Senge T，et al.Cell kinetic in epithelium and stroma of benign prostatic hyperplasia〔J〕.Urology,1997;158(1)：21721.

　　7 Jacobs SC,Story MT，Sasse J，et al.Characterization of growth factors derived from rat ventral prostate〔J〕.J Urol,1998;139(5):110610.

　　8 Story MT，Hopp KA，Molter M，et al.Characteristics of FGFreceptor expressed by stromal and epithelial cells cultured from normal and hyperplastic prostates〔J〕.Growth Factors,1994;10(4):26980.

　　9 Dulinska J，Laidler P，Labedz M.Comparative analysis of prostatic acid phosphatase and prostatespecific antigen mRNA levels in hyperplastic prostate stimulated with steroid hormones and growth factors〔J〕.Acta Biochim Pol,2002;49(2)：35768.

　　10 Pollan MC，Benghuzzi HA，Tucci M.Growth factor expression in early stages of benign prostatic hyperplasia upon exposure to sustained delivery of androgens〔J〕.Biomed Sci Instrum,2003;39：32934.

　　11 贾 彬，蔡文清，黎 玮，等.表皮生长因子对小鼠前列腺细胞增嫡凋亡的影响〔J〕.河北医科大学学报，2005;26(3)：2045.