三磷酸腺苷法肿瘤药敏检测在膀胱癌化疗中的临床研究

　　作者：李华镭1, 何崇生1，朱惠君2，黄剑飞2 作者单位：(南通大学附属医院1泌尿外科，2病理科，南通226001 )

　　【摘要】 目的：采用三磷酸腺苷法对膀胱癌组织标本进行肿瘤药物敏感筛选，为化疗选择方案确定提供客观依据。方法：80例膀胱癌新鲜标本行原代培养，同时用6种化疗药物进行检测。结果：标本均顺利完成检测，可评估率为100%，单药强敏感率为甲氨蝶呤(15.00%)、阿霉素(37.50%)、丝裂霉素(31.25%)、顺铂(26.25%)、羟基喜树碱(41.25%)，吡柔比星(56.25%)，不同药物对膀胱癌的敏感程度有差异(P<0.01);不同个体对不同药物的敏感度差异有统计学意义(P<0.01)。结论：不同膀胱癌标本对化疗药物的敏感程度有明显不同，三磷酸腺苷法可为膀胱尿癌的化疗方案确定提供指导作用。

　　【关键词】 膀胱癌;三磷酸腺苷法;肿瘤药物敏感;化学治疗

　　Adenosine triphosphate based tumour chemosensitivity assay in chemotherapy of bladder carcinoma in clinical research

　　LI Hualei1,HE Chongsheng1, ZHU Huijun2,et al (1Department of Urinary Surgery, 2Department of Pathology, the Affiliated Hospital of Nantong University,Nantong226001)

　　[Abstract] Objective: To investigate the heterogeneity of chemosensitivity in carcinoma of bladder using adenosine triphosphate based tumour chemosensitivity assay (ATP-TCA) and the feasibility of individual chemotherapy. Methods: ATP-TCA were used to determine the effect of 6 single drugs in surgical specimens from 80 patients with carcinoma of bladder. Results: All above these 80 specimens were complete detected successfully and the rate of evaluation was 100%. There were considerable differences in chemosensitivity between individuals. The most active single drugs in the assay was identified as Pirarubicin (56.25%). The sensitivity of other fivedrugs were methotrexate (15.00%), adriamycin (37.50%), mitomycin (31.25%), cisplatin (26.25%), hydroxy camptothecin (41.25%) in these specimens respectively. There was the heterogeneity of the in vitro chemosensitivity in carcinoma of bladder and had statistical significance obviously (P<0.01). Conclusion: The use of the ATP-TCA may provide a method of selecting appropriate anti-cancer drugs in carcinoma of bladder.

　　[Key words] Carcinoma of bladder;Adenosine triphosphate based tumour chemosensitivity assay; Tumour chemosensitivity; Chemotherapy膀胱癌是我国泌尿系统最常见的恶性肿瘤。本研究用先进的三磷酸腺苷法肿瘤体外药敏检测技术(adenosine triphosphate based tumour chemosensitivity assay, ATP-TCA)[1]对膀胱癌新鲜手术标本进行了检测，探讨该技术在膀胱癌临床个体化的化疗可行性。

　　1 材料与方法

　　1.1 临床资料 随机选取2005年1月~2005年12月南通大学附属医院泌尿外科手术的原发性膀胱癌标本共80例。所有患者术后病理诊断为膀胱尿路上皮癌，术前均未行放、化疗及免疫治疗。

　　1.2 实验设备和试剂 德国Berthold公司MPL -I自发光分析仪，新加坡ESCO公司超净工作台，美国Shellab公司2524-2型 CO2培育箱，日本Olympus CKX-41倒置显微镜，日本Eyela-Ntt水浴锅，德国Eppendorf公司离心机、单道/多道可调式移液器，美国BD公司Falcon滤网、15 ml离心管、96孔无菌微孔培养板，美国Nalge公司Syringe滤菌器。

　　ATP-TCA 试剂盒：包括完全培养剂(CAM培养液)、肿瘤组织消化酶、最大ATP抑制剂、肿瘤细胞ATP提取液、荧光-荧光素酶(LU-LU)均为德国DCS公司产品。

　　选取临床膀胱腔内常用化疗的6种药物(甲氨蝶呤、阿霉素、丝裂霉素、顺铂、羟基喜树碱、吡柔比星)。

　　1.3 ATP-TCA方法 取肿瘤组织标本，尽量避免坏死组织，生理盐水冲洗后1640 液浸泡。将肿瘤组织尽可能切成小碎块后放入肿瘤组织消化酶中，1~2 h后用滤网滤得肿瘤细胞浓悬液，与1640培养液加入15 ml离心管，800 r/min离心6 min，弃上清液，重复两次，加CAM培养液成细胞悬液。取少量细胞悬液行台盼蓝染色，倒置显微镜下观察细胞活性，并将悬液浓度调整为(1~2)×105/ml。

　　肿瘤化疗药物以CAM培养基为溶剂配制成800%检测药物浓度(test drug concentrations，TDC)，于96孔培养板内倍比稀释至6个梯度药物浓度：200%、100%、50%、25%、12.5%、6.25%TDC (A~F行)，设置G行为无药控制MO对照(no-inhibition control)，H行ATP 最大抑制控制MI对照(maximum inhibition control)。每孔加入0.1 ml肿瘤细胞悬液，于5%CO2、37 ℃、95%湿度下孵育，5~7天后加入肿瘤细胞ATP 提取液0.1 ml，混匀后置室温下20~30 min。每孔取0.1 ml混合液于检测板，加入LU-LU 0.05 ml，自发光分析仪检测，通过仪器专用评估软件得出系列数据：肿瘤生长抑制值(tumor growth inhibition, TGI), 曲线下面积(area under the inhibition curve, calculated by a trapezoidal rule, AUIC)，抑制90%生长药物浓度(relative 90% inhibitory concentration, IC90)，抑制50%生长药物浓度(relative 90% inhibitory concentration，IC50)， 敏感指数(natural logarithmic sum index calculated as 600-∑(TGI6.25+…+TGI200，IndexSUM)。

　　1.4 ATP - TCA 结果评估 参考Kurbacher的2005年最新标准[1]，将药物对肿瘤的作用分为4个等级：强敏感(High sensitivity, S):AUIC≥12 500/IndexSUM <300;IC90≤90% TDC;IC50≤25%TDC、中度敏感(Partial sensitivity, P)AUIC≥12 500/IndexSUM<300;IC90>90% TDC;IC50≤25% TDC、轻度敏感(Weak sensitivity, W)Any other with AUIC≥12 500/IndexSUM<300和耐药(Resistance, R)AUIC<12 500/IndexSUM≥300。

　　1.5 统计学方法 采Stata8.0软件进行统计分析，不同个体对不同药物的敏感的比较用kruskal-wallis秩和检验，组间数据率的比较用χ2检验。

　　2 结 果

　　本研究共检测标本80例，所有标本均顺利完成实验，标本可评估计率为100%。检测结果显示不同个体对不同药物具有不同的敏感性，用抗肿瘤药物，作药敏体外检测，敏感性结果见表1。

　　由表1可见，在此次检测80例膀胱尿路上皮细胞癌标本中，药物强敏感度顺序为：吡柔比星、羟基喜树碱、阿霉素、丝裂霉素、顺铂，甲氨蝶呤，可见不同药物对膀胱尿路上皮细胞癌的强敏感程度有差异(χ2=34.8830，P<0.01);不同个体对不同药物的敏感性程度差异有明显统计学意义(P<0.01)。

　　3 讨 论

　　ATP-TCA技术是目前最先进的体外肿瘤药敏检测方法，与以往的体外检测相比，本技术所需要的细胞数量较少，重复性强，易标准化，标本的可评估率较高[2]。其原理是有氧和ATP的条件下，荧光酶催化荧光素发出荧光，且强度与ATP含量呈正相关;又因为细胞死亡后，胞内的ATP被迅速水解，而活细胞中ATP含量基本恒定。所以，测得的胞内ATP含量可反映出存活细胞量[1]。采用96孔培养板及无血清培养基进一步提高ATP-TCA的可评价率、敏感性、特异性及临床预测化疗效果的准确性。在6个药物浓度梯度下同时检测肿瘤细胞对多种单药或联合药物的敏感性，得出药物的剂量-效应曲线，符合药物的体内药代动力学。

　　研究显示细胞内源性ATP 分析是最有预测性的细胞毒性测试方法[3]。近年来有报道ATP-TCA技术还应用在软组织肉瘤[4]、胃肠癌[5]等肿瘤的化疗药物选择。以往临床膀胱癌术后腔内化疗用药相对盲目，无个体化化疗的客观依据可循。虽然体外药敏检测和体内实验因血液循环和药物代谢等作用有差距，但膀胱癌腔内化疗，很大程度上两者的结果是接近的，比其它体内肿瘤的全身化疗更为理想。

　　本次研究结果显示，该技术的可评估率为100%，本次研究显示不同患者膀胱癌标本对化疗药物的敏感程度有明显的异质性，提示膀胱癌化疗前进行体外药敏检测，可筛选出患者相对敏感的药物，以避免盲目用药的损害。本文显示膀胱癌的吡柔比星强敏感率最高，与报道一致[6-7]，但敏感程度比较稍有差异，也同时体现了同一种类型肿瘤对化疗药物敏感程度是不同的。

　　本研究将检测结果与膀胱癌传统化疗方案相比，说明ATP-TCA技术对化疗的指导是可行的。需要注意的是，整个操作过程避免的污染，会导致实验失败，降低可评估率的同时导致医疗资源浪费。也要注意体外试验与体内情况有一定差异，在目前无特别理想的药敏检测方法的情况下，ATP-TCA 在临床个体化疗可以起到客观的指导作用。

　　【参考文献】

　　[1] Kurbacher CM，Cree IA. Chemosensitivity testing using microplate adenosine triphosphate-based luminescence measurements. Methods in Molecular MedicineTM, chemosensitivity volume 1: In vitro assays[J]. Human Press Inc, 2005, 110(1) :101-120.

　　[2] 黄剑飞，陈莉.肿瘤药物敏感检测方法//主编.现代病理学临床研究的基本问题[M].北京：科学出版社，2007：536-540.

　　[3] Ekwall B ,Sussman N. Intracellular ATP is the most accurate endpoint for in vitro prediction of cytotoxicity[J]. ATLA,2000 ,28(4):201-234.

　　[4] Lehnhardt M, Muehlberger T, Kuhneno, et al. Feasibility of chemosensitivity testing in soft tissue sarcomas[J]. World J Surg Oncol，2005, 3(1)：20-20.

　　[5] Whitehouse PA, Mercer SJ, Knight LA, et al. Combination chemotherapy in advanced gastrointestinal cancers: ex vivo sensitivity to gemcitabine and mitomycin C[J]. Br J Cancer. 2003，89 (12): 2299-2304.

　　[6] Yamada S, Deguchi T, Nezasa S,et al. A comparative study on in vitro chemosensitivity of urotherial cancers to three anthracyclines[J]. Gan To Kagaku Ryoho，1996，23(10):1339-1341.

　　[7] 李艳芬，田海梅，李磊,等.人膀胱癌原代培养体外药敏试验的研究[J].临床肿瘤学杂志,2006,11(8):598-599.