siRNA沉默Annexin1基因对膀胱癌T24细胞顺铂耐药的影响

　　作者：高琳 杨远航 徐万海 林相国 李建章 杨德君 王晓民 作者单位：哈尔滨医科大学附属第四医院泌尿外科，黑龙江 哈尔滨 150001

　　【摘要】目的 观察RNA干扰沉默膜联蛋白1(Annexin1)基因表达技术对膀胱癌T24细胞Annexin1基因表达和顺铂耐药的影响。方法 针对Annexin1基因不同部位设计并化学合成3对不同的靶向小分子干扰RNA(siRNA),脂质体介导瞬时转染膀胱癌T24细胞，转染后应用半定量RTPCR和Western印迹检测Annexin1 mRNA 和蛋白的改变，用MTT法检测沉默Annexin1表达在膀胱癌T24细胞对顺铂敏感性的变化。结果 转染siRNA后膀胱癌T24细胞Annexin1的mRNA和蛋白水平显著下降(P<0.05)，增强细胞对顺铂的敏感性(P<0.05)。结论 RNA 干扰Annexin1基因后其mRNA 和蛋白水平显著下降，并且增强T24细胞对顺铂的敏感性。

　　【关键词】 膀胱癌;膜联蛋白1;siRNA;顺铂

　　The changes of DDP sensitivity after annexin1 silencing by small interfering RNA of bladder cancer T24 cells

　　GAO Lin, YANG YuanHang, XU WanHai, et al.

　　Department of Urology, the Fourth Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150001, Heilongjiang，China

　　【Abstract】 Objective To explore the effects of annexin1 gene silencing by small interfering RNA(siRNA) on bladder cancer cells T24 and the sensitivity change of DDP. Methods Three siRNA targeting three different domains of annexin1 gene were designed, synthesized, and transfected into bladder cancer T24 cells by lipofectamineTM2000. After transfection, expression of annexin1 was detected by RTPCR and Westblotting. The cellular sensitivity to DDP was evaluated by MTT assay. Results Compared with the negative control (siRNANC) groups, transfection of three targeting siRNA in T24 cells decreased the expression of annexin1 mRNA and protein. Annexin1 gene silencing increased the sensitivity of T24 cells to DDP. Conclusions The chemically synthesized specific siRNA targeting annexin1 could effectively reduce the expression of annexin1 gene, increase the sensitivity of T24 cells to DDP.

　　【Key words】Bladder cancer; Annexin1 ; siRNA; DDP

　　膜联蛋白1(Annexin1)是上皮生长因子(EGFR)激酶的主要底酶，糖皮质激素刺激其产生和活性。Annexin1增强感染局部的凋亡表明它对肿瘤的诊断和治疗有重要意义，因此提出该蛋白质与肿瘤细胞的活性调节相关〔1，2〕。Annexin1与膀胱癌发生、发展密切相关。本研究针对Annexin1基因mRNA序列设计合成与之互补的双链小分子干扰RNA(siRNA)，在脂质体介导下转染膀胱癌T24细胞系，观察对Annexin1基因mRNA和蛋白表达及对顺铂敏感性的变化。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 细胞株

　　膀胱癌T24细胞株。

　　1.1.2 主要试剂

　　RNA干扰试剂盒(SilencerTM siRNA Construction Kit)购自美国Ambion公司。阳离子脂质体转染试剂盒LipofectamineTM2000、Trizol、MMLV购自Invitrogen 生命技术公司。RPMI1640、IMDM、胰蛋白酶购自Gibco公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 siRNA的设计及合成

　　根据基因库中Annexin1基因序列(GenBank Accession No.NM000700)和siRNA设计原则，应用Ambion生物公司的设计软件(siRNA Target Finder and Design Tools)，自Annexin1 mRNA的起始密码子开始，寻找“AA”二连序列，记下其3′端的19个碱基序列作为候选的siRNA靶序列。将候选序列在基因库中用Blast软件进行同源序列搜索，排除那些和其他基因编码序列或基因表达序列标签(EST)同源的候选序列。最终选择了3段21个碱基的siRNA序列(TⅠ、TⅡ、TⅢ)，分别靶向Annexin1基因的240260 (SⅠ) ，435455 (SⅡ)和 506526 (SⅢ)区域(表1)。另外，根据转染后细胞形态学变化，设计与TI(240 siRNA)序列含有同样核苷酸比例的随机对照siRNA(240c1，240c2)做为阴性对照，用Blast验证随机序列与基因库中其他已知人类基因序列没有同源性。利用针对三磷酸甘油醛脱氢酶(βactin)基因的正、反义寡核苷酸模板作为RNA干扰实验的阳性对照。设计的正反义寡核苷酸模板3′端均加上T7启动子引物5′CCTGTCTC3′，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

　　1.2.2 引物的设计与合成

　　设计了1对Annexin1的引物，序列：上游：5′GACCACCTCAACTCAAGGAC3′,下游：5′AGGAAGCTGGATGAAGAGAC3′，扩增片段长度 546 bp，同时设计了1对管家基因βactin的引物作为内参照，序列：上游：5′ACCACAGCTGAGAGGGAAATCG3′，下游：5′AGAGGTCCTTACGGATGTCAACG3′，扩增片段长度为290 bp，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

　　1.2.3 细胞培养

　　常规RPMI1640培养，至转染前夜，细胞培养液更换为用无血清和无抗生素的IMDM,置于37℃、5%CO2孵箱,转染后用20%胎牛血清(FBS)IMDM培养液,按常规方法培养,取处于对数生长期的细胞用于实验。用OptiMEMⅠ转染液 及脂质体LipofectamineTM 2000转染试剂，按试剂盒说明优化转染条件，分别将3对siRNA和阳性对照筛选出的干扰序列的scramble siRNA(siRNAneg)以400 nmol/L的终浓度加入细胞培养液，孵育24、48、72 h后收获细胞进行检测。实验重复3次。

　　1.2.4 半定量RTPCR检测转染前后膀胱癌T24细胞Annexin1 mRNA的表达水平

　　采用Trizol试剂盒提取细胞总RNA，用2 μg总RNA进行cDNA的合成，半定量RTPCR方法检测siRNA转染后不同时间点24、48、72 h细胞中Annexin1 mRNA表达水平的变化，βactin作内对照。PCR 扩增条件Annexin1：95℃预变性5 min;94℃变性40 s，58℃复性1 min，72℃延伸1 min，共33个循环;72℃延伸10 min。βactin：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，63℃退火1 min，72℃延伸2 min，共30个循环;72℃延伸10 min。取适量PCR扩增产物，在2%琼脂糖凝胶电泳(80 V，25 min)，溴化乙啶(EB)染色，紫外灯下观察结果并拍照。用凝胶成像分析仪进行半定量分析，以检测基因βactin的相对亮度表示该基因mRNA的相对表达量。表1 Nucleotide sequences of the Annexin1靶向siRNA的序列(略)

　　1.2.5 Western印迹检测转染前后膀胱癌T24细胞Annexin1蛋白的表达

　　取状态良好对数生长期细胞5×106个，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗2遍，于冰上加冷的细胞裂解液，制备细胞总蛋白，Lowry法蛋白定量。将样品置于5×十二烷基硫酸钠(SDS)凝胶加样缓冲液中，100℃加热10 min使蛋白质变性，聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白免疫法(Western)印记，按0.1 ml/cm2的量加入封闭液和适量稀释的抗体，于摇床上室温2 h，PBS漂洗滤膜3次，加入辣根过氧化物酶标记二抗，将漂洗过的硝酸纤维素膜移至上述底物溶液中，轻轻摇动，蛋白条带的颜色达到要求，即用水冲洗，滤纸吸干，拍摄膜的照片，结果保存。内参对照使用小鼠抗人βactin(稀释度为1∶10 000)，以保证上样量一致。

　　1.2.6 siRNA和脂质体的细胞毒性检测

　　细胞用无血清和无抗生素的培养液洗涤重悬，每孔2×104加入96孔板。分别加入用OptiMEMⅠ稀释的siRNA(终浓度为100 nmol/L)或Lipofectamine2000(终浓度为2 ml/L)，6 h后加入含20%血清的培养液补足血清，72 h后分别加入5 mg/ml的噻唑蓝(MTT)，每孔20 μl，37℃置4 h，弃上清，每孔加入100 μl二甲基亚砜(DMSO)，待完全溶解后，测定其在570 nm的吸光度，并计算细胞存活率。对照孔细胞中加入等量的OptiMEMⅠ代替脂质体或SiRNA，其余培养条件与处理组相同。

　　存活率=处理孔OD570-空白孔OD570对照孔OD570-空白孔OD570×100%

　　1.2.7 MTT法检测细胞对顺铂敏感性的变化

　　取对数生长期的细胞，用含有10%血清的RMPI1640培养液调整细胞浓度为1×105/ml，接种于96孔培养板中，每孔180 μl，在37℃，5% CO2条件下培养24 h。分组加药，每个浓度设3个平行孔，处理组加不同浓度的顺铂，阴性对照组加等体积的生理盐水，使每孔终体积为200 μl，培养68 h后，每孔加入5 mg/ml的MTT 20 μl，37℃继续培养4 h，2 000 r/min离心10 min，弃上清，每孔加入100 μl DMSO，振荡至沉淀完全溶解，在酶标仪上检测570 nm光密度(OD)值。按以下公式计算肿瘤细胞生长抑制率。以同一药物的不同浓度对肿瘤细胞生长抑制率作图可得到剂量反应曲线，求出该药物的半数抑制浓度IC50，即细胞存活率减少50%时的药物剂量。

　　抑制率(%)=对照组OD值-处理组OD值对照组OD值×100%

　　1.3 统计学处理

　　应用 SPSS11.0软件进行统计分析，数据以x±s表示，两组均数间比较采用t检验，多组均数间比较采用方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 siRNA对膀胱癌T24细胞Annexin1mRNA表达的影响

　　经AlphaEaseFCTM(Alpha Innotech)软件分析，以40 nmol/L浓度转染T24细胞24 h后siRNAⅠ、Ⅱ、Ⅲ组mRNA表达水平明显降低，在24 h下调(80.63±0.24)%，(t=474.3，P=0.001);在48 h下调(38.9±0.85)%，(t=64.833，P=0.01)，72 h恢复正常。见图1。

　　2.2 siRNA对膀胱癌T24细胞Annexin1蛋白表达的影响

　　与随机对照的siRNA相比，靶向Annexin1的siRNA转染后细胞内Annexin1蛋白表达明显下降，并且与RTPCR结果一致。见图2。

　　2.3 siRNA转染后膀胱癌T24细胞对顺铂敏感性的变化

　　MTT法显示，以40 nmol/L浓度转染T24细胞24 h后siRNAⅠ、Ⅱ、Ⅲ组细胞对顺铂的IC50值(μg/ml)均有不同程度的下降，从30.27下降到7.81、6.94和5.75，顺铂敏感性显著增加(P<0.05)。同时以不同浓度顺铂培养后细胞生存率亦明显下降，与对照组比较差异显著(P<0.05)，见图3。

　　2.4 siRNA和脂质体的细胞毒性检测结果

　　T24细胞经靶向Annexin1基因的siRNA或oligolipofectamine处理后计算细胞存活率，与未处理的T24细胞相比，没有显著统计学差异，显示siRNA及脂质体本身在实验条件下对细胞基本没有毒性作用。

　　3 讨 论

　　膀胱癌是泌尿系统中最常见的肿瘤之一，在美国其发病率居全身各部位肿瘤的第四位，在我国则排至第八位，近年来发病率呈上升趋势〔3〕。目前，就Annexin1的表达缺失是否与膀胱癌细胞的异常增殖潜力相关以及对化疗药物的敏感性尚未明了。

　　RNA干扰是由双链RNA分子在mRNA水平关闭相应序列基因表达使其沉默的过程，是一种典型的转录后基因调控方法，此时启动子是活跃的，靶基因能够被转录，但不能正常累积mRNA。其优点首先表现在siRNA只引起与其同源的mRNA降解，而其他基因的表达不受影响，因此具有高度的序列专一性。实验证实，导入细胞的siRNA只能引起同源基因表达的抑制，而无关基因不受影响〔4〕。在siRNA序列中配对的19～21nt中如果只改变一个核苷酸，就可以使该siRNA序列不对靶mRNA起作用，证明RNA干扰有明显的特异性。其次RNA干扰是通过自身放大机制来发挥作用，极少量的dsRNA就能有效地抑制靶基因的表达，因此与反义寡核苷酸等基因封闭技术相比，具有高效性〔5〕。另外RNA干扰操作简便快捷，利用RNA干扰技术，甚至可以在1 w之内关闭10个基因。

　　Elbashir等〔6〕首次报道siRNA在哺乳动物体外培养细胞中能够成功的诱导特异基因受阻。作为一种有效抑制基因表达的方法，RNA干扰技术在近几年被广泛用于基因的功能研究。双链siRNA的合成是进行RNAi研究的关键〔7〕，本研究中采取了体外转录法，即在噬菌体RNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶等作用下，以连有噬菌体启动子的线性DNA为模板，直接合成出特异双链siRNA。RNA聚合酶是体外转录合成siRNA的关键酶，除了在本实验中用到的T7 RNA聚合酶，其他通用的RNA聚合酶还有T3、SP6 RNA聚合酶，它们均是以DNA为模板的RNA聚合酶。DNA模板必须连有特异的启动子序列，启动子区域是噬菌体RNA聚合酶结合和RNA开始合成的部位，因此本实验在设计寡核苷酸模板的时候，3′端均加上T7启动子引物5′CCTGTCTC3′。在RNA聚合酶结合到双链DNA启动子后，聚合酶分开双链DNA模板，并以3′～5′链作为模板合成出互补的5′～3′RNA链，合成出的正反义RNA链经杂交即可得双链RNA。在本研究中，以AA开头针对597 bp的Annexin1 cds区的靶序列共有26个，其中GC碱基含量在50%以下的有25个，对其进行Blast分析，最终选择了240～260(SⅠ)，435～455(SⅡ)和506～526(SⅢ)的3段序列，其中SⅠ siRNA靶序列的GC含量为43.9%，SⅡ siRNA靶序列的GC含量为39.2%，SⅢ siRNA靶序列的GC含量为41.2%。结果表明3段siRNA序列都有抑制Annexin1基因表达的作用，但是SⅡ siRNA抑制作用要更强一些。通过研究3对不同的靶向干扰序列和1对阴性对照序列，发现在mRNA水平3对靶向序列均可抑制Annexin1的表达，在蛋白水平也获得较高的抑制效果。

　　本研究还提示转染T24细胞后siRNAⅠ、Ⅱ、Ⅲ组细胞对顺铂的IC50值(μg/ml)分别下降了3.8、4.4和5.3倍，顺铂敏感性显著增加。通过干扰Annexin1基因，可以改变膀胱癌T24细胞生存能力，对照组在不同的顺铂浓度下(20～80 μg/ml)生存率分别为94.54%、87.22%、58.39%和42.83%，经3个siRNA干扰后生存率明显下降。膀胱癌T24细胞是顺铂耐药的细胞〔8〕，siRNA干扰后对顺铂敏感性增加，从而为顺铂耐药的治疗提供了一个很好的思路。

　　【参考文献】

　　1 SilistinoSouza R，RodriguesLisoni FC，Cury PM,et al. Annexin1:differential expression in tumor and mast cells in human larynx cancer〔J〕. Int J Cancer，2007;120(12):25829.

　　2 Ang EZ，Nguyen HT，Sim HL,et al.Annexin1 regulates growth arrest induced by high levels of estrogen in MCF7 breast cancer cells〔J〕.Mol Cancer Res，2009;7(2):26674.

　　3 Baffa R，Letko J,Mc Clang C,et al.Molecular genetics of bladder cancer：targets for diagnosis and therapy〔J〕.J Exp Clin Cancer Res，2006;25 (2)：14560.

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　　5 PalBhadra M，Bhadra U，Birchler JA.RNAi related mechanisms affect both transcriptional and posttranscriptional transgene silencing in Drosophila〔J〕.Mol Cell，2002;9 (2):31527.

　　6 Elbashir SM,Harborth J,Lendeckel W,et al.Duplexes of 21nucleotide RNAs mediate RNA interfernce in cultured mammalian cells〔J〕.Nature,2001;411 (6836)：4948.

　　7 Berezhna SY，Supekova L，Supek F,et al.siRNA in human cells selectively localizes to target RNA sites〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2006;103(20):76827.

　　8 Konstantakou EG,Voutsinas GE,Karkoulis PK,et al.Human bladder cancer cells undergo cisplatininduced apoptosis that is associated with p53dependent and p53independent responses〔J〕.Int J Oncol,2009;35(2)：40116.