转sTNFR基因处理对供心缺血/再灌注损伤的保护作用

　　作者：韩从辉，郑巍，董秉政,郝林,詹鸣,李怀富,张明,闵志廉,郑克立 作者单位：1.徐州市中心医院泌尿外科,江苏徐州221009;　2.中山大学第五医院泌尿外科，广东珠海519000; 3. 第二军医大学器官移植研究所，上海200003

　　【摘要】 目的 研究可溶性肿瘤坏死因子受体(sTNFR)基因直接体外灌注转染供者器官的效果，利用小鼠异位心脏移植模型探讨sTNFR基因转染对供心缺血/再灌注损伤的保护机制。方法 实验分3组，每组C57/BL6(H-2Kb)供体鼠和BalB/c(H-2Kd)受体鼠各10只，在0～4℃溶液中对3组C57/BL6(H-2Kb)小鼠的供心分别经主动脉缓慢灌注含编码小鼠sTNFR-p55基因的复制缺陷重组腺病毒载体(AdmsTNFR组)、复制缺陷重组腺病毒载体AdHCVsp1LacZ(AdmLacZ组)的PBS和单纯PBS(对照组)，灌注1 h后，将供心移植给BalB/c(H-2Kd)受体鼠。检测各组移植受体鼠外周血血清sTNFR的表达水平和移植物浸润细胞(GIC)的数量，并分析AdmsTNFR基因修饰后GIC的同种反应活性(MLR)。结果 以2×1012 pfu/L的滴度转染移植心脏后，12 h即可在AdmsTNFR组小鼠的血清中检测到高水平的sTNFR-p55表达，24 h达到分泌高峰，为(59.5±6.5 )μg/L;而AdmLacZ组24 h的sTNFR-p55水平为(1.5±0.56 ) μg/L(P<0.05)，对照组更低;术后14 天，AdmsTNFR组仍持续表达有效高水平的sTNFR-p55〔(20.1±3.7)μg/L〕。AdmsTNFR组移植心脏的GIC数目为(0.5±0.12)×106/孔，明显低于对照组和AdmLacZ 组的(5.0±2.2)×106/孔(P<0.05)，其比例为1∶10～1∶20。将不同组的GIC与γ射线(20 Gy)灭活的供体鼠来源的T细胞作72 h MLR，AdmsTNFR组的GIC增殖受到了明显的抑制，AdmLacZ 组和对照组的GIC则显示较强的对同种刺激的增殖活性。结论 在低温(0～4℃)的条件下可以将编码sTNFR基因的腺病毒成功地转入移植心脏，通过基因表达可长时间维持有效的sTNFR-p55的局部浓度，减轻了受体鼠移植器官内的炎性细胞浸润，并抑制移植器官内浸润细胞的同种反应活性。

　　【关键词】 sTNFR;转基因;器官移植;心脏;缺血/再灌注损伤;小鼠

　　基金项目：江苏省卫生厅基金(H200557)，广东省珠海市科委基金(20041051)

　　Protective effect of sTNFR gene transduction on ischemia-reperfusion injury of donor′s heart

　　HAN Conghui, ZHENG Wei, DONG Bingzheng, HAO Lin, ZHAN Ming, LI Huaifu, ZHANG Ming, MIN Zhilian, ZHENG Keli

　　1. Department of Urology, Xuzhou Central Hospital, Xuzhou, Jiangsu 221009,China; 2. Department of Urology, The Fifth Affiliated Hospital of SUN Yat-sen University, Zhuhai， Guangdong 519000; 3. Center of Organ-Transplantation, Affiliated Changzheng Hospital, The Second Military Medical University of PLA, Shanghai 200003

　　Abstract: Objective To investigate the transfection effects of sTNFR gene directly perfused to donor hearts in vitro, and to explore the protective mechanism of sTNFR gene transduction to donor hearts against ischemia-reperfusion injury using the model of heterotopic heart transplantation in mice. Methods The experiment was carried out in three groups, with each group containing 10 donor mice and 10 recipient mice. The donor hearts were infused with iced saline containing replication-defective recombinant adenovirus encoding murine sTNFR-p55 (for AdmLacZ sTNFR gene group), replication-defective adenovirus vector AdHCVsp1LacZ (for AdmLacZ vector group) and PBS (for control group) respectively, for 1 h, before the donor hearts were transplanted to the recipients using cervical heterotopic heart transplantation method. The sTNFR-p55 level in serum and the graft infiltrating cell (GIC) count in each recipient group were examined, with the allogeneic MLR in GIC analyzed as well. Results High level of sTNFR-p55 was detected in the serum of the AdmsTNFR gene group 12 hours after the transfection at MOI 2×1012 pfu/L, which reached its peak (59.5±6.5) μg/L 24 hours after the transfection. In contrast, the sTNFR-p55 level in AdmLacZ vector group was staying at a much lower level (1.5±0.56) μg/L (P< 0.05) 24 hours after the transfection. The sTNFR expression could still be kept at high level in the serum 14 days after transplantation in AdmsTNFR gene group. The GIC count in AdmsTNFR gene groups was (0.5±0.12) ×106 /well, much lower than that in AdmLacZ vector group (5.0±2.2) ×106/well (P<0.05). When GIC were cocultured with the γ-irradiation-inactivated allogeneic lymphocytes from donor mice for 72 h MLR, the proliferation of GIC was found obviously inhibited in the AdmsTNFR gene group, as compared with that in the other two groups. Conclusion These data indicate that adenovirus-mediated sTNFR-p55 gene can be transferred successfully to cardiac allografts by direct perfusion under hypothermic conditions (0-4℃) in vitro, which can bring about sustained high local concentration of sTNFR-p55, decrease of GIC count in the graft heart and inhibition of the proliferation of GIC.

　　Key words: sTNFR; gene transduction; organ transplantation; heart; ischemia/reperfusion injury; mice

　　器官保存在维持离体器官的功能方面起着最为重要的作用。在器官切取后等待移植手术的时间内，供器官质量的好坏直接影响到外科手术后移植器官的功能恢复。缺血/再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury, I/RI)是影响移植器官早期功能恢复的主要因素之一，近期的研究已经证实炎症反应在缺血/再灌注损伤中的重要作用，因此我们试图从抑制炎症反应的角度探索防治缺血/再灌注损伤的措施。肿瘤坏死因子 (tumor necrosis factor，TNF)是此I/RI过程中的关键性的致炎因子，其表达增高是该过程的关键环节。本试验利用腺病毒载体分别向切取后低温保存的动物器官组织中转入TNF的可溶性受体(soluble TNF receptor, sTNFR)基因，通过灌洗和保存使供器官局部表达sTNFR，在移植物局部抑制和减轻TNF-α的致炎症反应作用，减少缺血/再灌注损伤的风险，从而达到有利于移植器官功能恢复的目的。

　　1 材料和方法

　　1.1 动物

　　8～12周雄性BalB/c(H-2Kd)和C57/BL6(H-2Kb)小鼠，体重20～22 g(±1.5 g)，购自第二军医大学实验动物中心，在无病原的环境中饲养。

　　1.2 试剂、仪器和细胞系

　　IFN-γ、IL-4、 IL-10和 IL-2的ELISA 检测试剂盒购于Endogen公司 (Woburn MA Co, USA)，sTNFR-p55的ELISA 检测试剂盒购于 BioSource Europe S.A公司(Belgium)，编码小鼠sTNFR-p55基因的复制缺陷重组腺病毒载体(AdmsTNFR-p55)由加拿大McGill大学路遥博士惠赠，复制缺陷重组腺病毒载体AdHCVsp1LacZ(AdmLacZ)为靶病毒对照。AdmsTNFR-p55 和AdHCVsp1LacZ分别用 293 肿瘤细胞株(人胚肾肿瘤细胞株)扩增，感染细胞经反复冻融3次，收获上清，置-70℃保存，待用。病毒滴度检测由标准病毒滴度检测程序检测，以空斑形成单位pfu/L表示。Ⅳ型胶原酶购于Sigma 公司，完全细胞培养液由RPMI 1640加入体积分数为10%的灭活FCS (购于美国Gibco公司)、2 mmol/L 谷氨酰胺、1×105 U/L青霉素和100 mg/L 链霉素配制，PBS购于上海第一医药公司。所有细胞均在37℃、5% CO2和饱和湿度的环境下，悬浮于完全细胞培养液培养。液闪计数仪购于美国Wallac公司，80-1台式低速离心机购于上海医疗设备公司。

　　1.3 供体心脏体外灌注和实验分组

　　在0～4℃乳酸林格液的冰水混合物中进行供心〔C57/BL6(H-2Kb)鼠〕的体外灌注。2×1012 pfu/L的AdmsTNFR或AdmLacZ溶于总体积为0.5 ml、0～4℃的PBS中，经供心的主动脉缓慢灌注，1 h后将供心移植给BalB/c(H-2Kd)受体鼠。对照组灌注0.5 ml不含病毒的PBS。

　　实验分3组，每组10只C57/BL6(H-2Kb)供体鼠和10只BalB/c(H-2Kd)受体鼠，第1组为应用AdmsTNFR灌注过的C57/BL6(H-2Kb)小鼠供心进行移植(AdmsTNFR组)，第2组为应用AdmLacZ灌注过的C57/BL6(H-2Kb)小鼠供心进行移植(AdmLacZ组)，第3组为不含病毒的PBS灌注过的C57/BL6(H-2Kb)小鼠供心进行移植(对照组)。按照不同的实验目的进行取样和观察。

　　1.4 小鼠心脏异体移植模型制备

　　参照文献报道的颈部套管法建立小鼠异位心脏移植模型[1]，并作简要改进。整个操作在手术显微镜下进行，放大倍数为10倍。供鼠以苯巴比妥钠腹腔注射麻醉，开胸后经下腔静脉向心脏注入5×104 U/L的4℃肝素生理盐水0.5 ml，立即将心脏连同双肺完整切下，置4℃生理盐水中修整。切断左肺动脉装套管，游离主动脉至头臂干处切断。其余血管及双肺结扎切除。受体鼠〔BalB/c(H-2Kd)〕麻醉完成后切开右侧颈部皮肤，在血管夹阻断下切断右侧颈外静脉及颈总动脉，颈总动脉上套管，将供心的左肺动脉套管装入受体颈外静脉，受体颈总动脉套管装入供心主动脉，分别结扎固定后开放血管夹。术后每天触摸移植心脏观察存活情况。

　　1.5 移植受体鼠外周血血清sTNFR表达水平检测

　　于移植后的不同时间，从3组受体鼠的尾静脉获取外周血清50 μl，用sTNFR-p55的ELISA试剂盒检测各组外周血血清sTNFR-p55水平。

　　1.6 移植物浸润细胞(grafts infiltrating cells，GIC)的分离

　　于移植后第7天，处死受体小鼠，获取3组的移植心脏，浸于质量浓度为100 mg/L的Ⅳ型胶原酶溶液中，37℃消化30 min。收集消化后的心肌细胞，用PBS洗2遍，用Percoll 细胞分离液进行梯度离心(80-1台式低速离心机，2 000 r/min，30 min)，收集悬于顶层(含消化的间充质细胞和残余心肌细胞) 和界面的细胞(即GIC)。PBS洗2遍，用RPMI 1640完全培养基将收获的细胞计数调至2×109/L，待用。

　　1.7 GIC的同种混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction,MLR)分析

　　将收获的GIC以不同的比例(分别为2.5∶1、5∶1、10∶1、20∶1)与γ射线(20 Gy)灭活的C57/BL6鼠脾T细胞作72 h混合培养。混合培养在圆底96孔板内进行，每个比例设3个复孔。在培养的最后12 h，加入[3H]-胸腺嘧啶脱氧核苷(TdR)37 kBq/孔，用液闪计数仪测定[3H]-TdR 掺入，以每分钟脉冲数(counts/min)表示。

　　1.8 统计学处理

　　应用SPSS 10.0统计软件进行数据处理，结果以±s表示，采用t检验和方差分析检验各组均数间的差异，检验水准：α=0.05。

　　2 结 果

　　2.1 受体鼠sTNFR-p55表达水平

　　以2×1012 pfu/L的滴度转染移植心脏后，sTNFR-p55的表达水平较为理想，12 h即可在AdmsTNFR组的血清中检测到高水平的sTNFR-p55的表达，24 h达到分泌高峰 (59.5±6.5)μg/L;AdmLacZ 组24 h产生sTNFR-p55的水平仅为(1.5±0.56)μg/L，而对照组结果更低;AdmsTNFR组与AdmLacZ 组、对照组相比差异有显著性(P<0.05)。AdmsTNFR组sTNFR-p55的表达在24 h达到高峰后呈不断下降趋势，但术后14天仍持续表达有效水平的sTNFR-p55，为(20.1±3.7)μg/L。AdmLacZ 组和对照组术后1周内一直呈低水平的表达，但在第8～10 天有一个数值较高的峰值〔(57.7±6.4)μg/L〕，提示sTNFR-p55与TNF-α水平明显相关，排斥以后恢复至正常水平(图1)。

　　2.2 AdmsTNFR基因转染对GIC的MLR抑制作用

　　移植各组的GIC的数目存在明显差别，AdmsTNFR组移植心脏的GIC数目为(0.5±0.12)×106/孔，明显低于对照组和AdmLacZ 组的(5.0±2.2)×106/孔(P<0.05)，其比例为1∶10～1∶20。用FACS分析移植物浸润细胞MHC-Ⅱ分子Iad抗原的阳性率，表明90%的细胞为受体来源的Iab(+)细胞。AdmLacZ 组和对照组的GIC以T细胞为主，CD4(+)T细胞与CD8(+)T细胞的比例为4∶1～5∶1;AdmsTNFR组的T细胞在GIC中的比例明显下降。

　　将不同组的GIC与γ射线(20 Gy)灭活的供体鼠来源的T细胞作72 h的MLR(表1)，AdmsTNFR组的GIC增殖受到了明显的抑制，AdmLacZ 组和对照组的GIC显示较强的对同种刺激的增殖活性。说明AdmsTNFR基因转染通过减少炎性细胞浸润和抑制GIC同种特异性反应性来抑制局部免疫应答反应。表1 AdmsTNFR基因转染对GIC的MLR抑制作用(略)

　　3 讨 论

　　缺血/再灌注损伤的本质是一种炎症反应，促进炎症反应的细胞因子有白细胞介素-1(IL-1)、TNF、IL-6等。TNF-α 在缺血/再灌注损伤炎症反应的多个环节上起着至关重要的作用[2]，细胞因子中，TNF-α1是对炎症最有影响的起直接作用的物质之一。许多炎症都可由TNF-α受体拮抗剂来预防和消除，通过阻断TNF-α的释放、抑制TNF-α的生成能防止或消除炎症[3-4]。在无免疫反应的情况下，器官缺血/再灌注后早期组织内TNF-α的mRNA表达即迅速升高，其中一部分是由缺血/再灌注诱导组织产生，另一部分则是由浸润的炎性细胞所产生[5]。因此，在移植物局部抑制TNF-α的作用将会极大地有利于缺血/再灌注损伤的防治[6]。

　　TNF-α的生物学功能由膜型TNF受体(TNFR)所介导，对应于膜型TNFR，存在2种可溶性TNF受体(sTNFR)，即sTNFR-p55和sTNFR-p75，主要功能是中和以及拮抗过多的TNF，减少TNF造成的损伤，中止炎症反应。sTNFR与多种疾病，如肿瘤、感染、自身免疫性疾病、移植排斥反应等的诊断和治疗密切相关[7]。炎症反应时，机体通过膜受体脱落及蛋白合成机制产生sTNFR。膜受体脱落产生的sTNFR可调节炎症反应的强度和区域，起机体自我保护作用。sTNFR-p55的基因转移已被证明可通过阻断TNF-α毒性抑制各种炎症反应[8-9]，并可延长同种异体胰岛移植物的存活，同时阻断抗腺病毒的免疫应答[10]。但是这种转基因治疗在大器官移植中的研究及其在抗移植器官缺血/再灌注损伤中保护效果的研究都比较少。

　　本实验结果表明，在低温(0～4℃)的条件下可以将编码sTNFR基因的腺病毒成功地转入心脏移植物，通过基因表达可以长时间维持局部有效的sTNFR-p55的浓度。通过对AdmsTNFR基因转染后移植心脏内浸润细胞的数目和活性的分析发现，AdmsTNFR组的移植心脏内的炎性细胞浸润明显减少。通过分析GIC同种刺激下的增生活性，提示AdmsTNFR基因表达对浸润的CD4(+)T和CD8(+)T细胞活性均产生了抑制作用。因此，sTNFR作为TNF-α拮抗剂在移植器官的基因转染可以于局部微环境内抑制针对同种抗原的免疫应答反应，表现为减轻移植物内的炎性细胞浸润、抑制GIC的同种反应活性。

　　我们认为，利用灌洗和保存供器官转基因方法具有与其他转基因治疗方法不同的特点：供器官缺血/再灌注损伤导致的炎症反应范围局限在供器官内，基因表达产物大量表达在供器官局部，随血流散布全身的产物极少，使得维持较长时间的转基因治疗成为可能，避免其他转基因治疗全身给药在局部往往尚未达到应有浓度时副作用已大得难以承受的缺陷。在下一步的研究中，我们还将对直接基因载体灌注修饰供器官后对移植物局部的免疫调节和宿主系统免疫反应状态产生的影响和受体小鼠移植物存活的状况进行进一步的观察，以便更加深入地探讨AdmsTNFR基因直接灌注转染供器官的免疫学机制。

　　【参考文献】

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