Calphostin C 逆转人肾癌内源性阿霉素耐药作用的机制

　　作者：刘涛 荆宏伟 孔垂泽 作者单位：中国医科大学附属第一医院泌尿外科，辽宁 沈阳 110001

　　【摘要】目的 探讨蛋白激酶C alpha抑制剂对肾癌细胞多药耐药(MDR)逆转作用的机制。方法 应用荧光显色法、RTPCR检测PKCα基因的表达情况及PKCα cDNA转染肾癌7860细胞前后细胞中MDR1表达的变化;采用〔14C〕ADM 标记法检测PKCα激动剂Calphostin C、抑制剂PMA作用PKCα/7860细胞系内阿霉素(ADM)浓度变化;测定PKC激动剂以及与PKC抑制剂对肾癌细胞细胞生长抑制率;分别测定ADM与PKC激动剂以及与PKC抑制剂协同作用后,7860细胞和肾癌转染细胞系PKCα/7860耐药性的变化。结果 肾癌转染细胞系PKCα/7860的MDR1表达水平高于肾癌7860细胞。Calphostin C、PMA作用后MDR1基因表达分别出现升高和降低。Calphostin C协同ADM对肾癌细胞具有较强的抑制作用，且抑制作用呈浓度依赖关系。ADM与PKC抑制剂协同作用的PKCα/7860细胞系耐药性明显降低。结论 PKCαcDNA的转染可以提高7860细胞的耐药性，而PKCα的选择性激动剂和选择性抑制剂则分别可以增加和逆转肾癌细胞对ADM的耐药性，其途径可能是通过促使肾癌细胞内源性ADM耐药发生变化进而影响细胞内化疗药物的浓度来实现的。

　　【关键词】 蛋白激酶C;多药耐药;肾癌

　　在众多肿瘤组织中，肾癌细胞存在许多独特的特征，包括出现多药耐药(MDR)、对放疗效果不佳等。肾癌细胞内源性耐药表型的出现，使其对多种化疗药物失效。蛋白激酶C(PKC)作为一类钙磷脂依赖性磷酸化酶，广泛存在于机体内并分布在几乎所有的组织和器官中。不典型PKC(aPKC)包括PKCμ，ι 和 ζ三种亚型〔1〕。本研究前期工作已经证明肾癌组织中PKCα含量异常增高〔2〕。近期研究提示PKCα伴随MDR表型而呈现高表达现象〔3〕，提示PKCα抑制剂可能有助于提高抗癌药物发挥抑制肿瘤细胞生长的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　7860人肾癌细胞，购自上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。PKCα要cDNA全长开放阅读框架(ORF)、羧基端融合绿色荧光蛋白(Cterminal fusion to green fluorescent protein)的表达载体pcDNADEST47、Script Firststrand Synthesis For RTPCR试剂盒、脂质体 Lipofectamine2000plus、Trizol试剂、GatewayBP和LR ClonaseTM enzyme mix购自Invitrogen公司;G418购自 Gibercol BRL公司;PKC抑制剂Calphostin C、PKC激动剂佛波醇酯 (PMA)和Adriamycin购自Sigma公司;〔14C〕Adriamycin购自GE Healthcare Life Sciences公司。Pyrobest DNA聚合酶购自Takara公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养

　　细胞置于37℃培养，RPMI1640培养基中，加入10%胎牛血清(FBS)，2 mmol/L谷氨酰胺及25 mmol/L HEPEs,置入湿润的5%CO2培养箱中培养细胞。每2～3 d传代1次，取对数生长期的细胞进行实验。

　　1.2.2 质粒构建 人PKCα cDNA采用GatewayTM技术、BP反应技术和LR反应重组技术及Pyrobest DNA聚合酶，创建羧基端融合绿色荧光蛋白表达PKCα的pcDNADEST47PKCαGFP表达载体。扩增引物：5′ATGGCTGACGTTTTCCCGGGCAA3′;5′CATACTGCACTCTGTAAGATGGGG3′。扩增片段度为2 245 bp。

　　1.2.3 基因转染及鉴定

　　取对数生长期7860细胞，以4×105/每孔接种12孔板，待完全贴壁后开始转染。以pcDNADEST47PKCαGFP表达载体作为目的基因，按以下方法进行脂质体转染：0.6 μg DNA，2 μl plus,2 μl Lipofectamine2000plus,加入无血清RPMI1640培养液至反应终体积为500 μl，吸取孔内培养液，加入转染液37℃孵育3～5 h，换含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，37℃孵育24 h，Fluoview共焦激光扫描显微镜下，激发波长为480 nm，吸收波长为510 nm。以FITC过滤观察绿色荧光蛋白的即时表达，观察转染效率同时观察荧光在细胞内亚细胞区域的分布变化。转染48 h后，加入G418进行筛选,浓度为400 ng/ml。培养2 w,部分细胞仍能表达GFP,但表达程度不一。约4 w后，产生阳性克隆，传代扩增，命名为PKCα/7860细胞。然后用Trizol提取PKCα/7860细胞株总RNA(以7860细胞作为对照)，按Invitrogen公司Super Script Firststrand Synthesis For RTPCR步骤进行PKCα逆转录，引物同上(以βactin作为内参照，引物见表1)。

　　1.2.4 PKCα激动剂、抑制剂作用前后MDR1基因表达变化

　　以100 nmol/L PMA或100 nmol/L Calphostin C作用PKCα/7860细胞，RTPCR检测PKCα激动剂、抑制剂作用前后细胞内MDR1表达(引物见表1)。表1 各PCR引物及产物长度(略)

　　1.2.5 细胞内霉素(ADM)浓度的测定

　　取对数生长期的PKCα/7860细胞,分别计数1 ×105个细胞接种于24孔板中,加入RPMI 1640培养24 h,待细胞贴壁后，以100 nmol/L PMA或100 nmol/L Calphostin C预作用PKCα/7860细胞，弃去培养液，更换终浓度为0.5 μmol/L的〔14C〕ADM无血清培养液,5%CO2,37℃温育1.5 h，使其到达稳定期,离心弃去含药培养液,用冷PBS 将细胞洗3 次。将细胞在含0.5 %SDS 的PBS 0.2 ml中重悬,裂解,液体闪烁计数仪测定其放射性，重复3次。

　　1.2.6 PKCα 激动剂、抑制剂对肾癌细胞生长抑制影响

　　以MTT法，将PKCα/7860细胞接种96孔细胞培养板，37℃孵育12 h后，先以100 nmol/L PMA或0，50,100,150,200 nmol/L Calphostin C预作用2 h，PBS轻洗3次后，更换含0.5 μmol/L的ADM培养液，每孔100 μl，每个浓度设6复孔，对照只加培养液;37℃孵育36 h后，加入MTT，37℃孵育4 h，更换DMSO，37℃孵育4 h后，酶标仪540 nm读取光密度值(OD)。以不加PMA或Calphostin C预处理的PKCα/7860为对照计算细胞生长抑制率。

　　1.2.7 PKCα 激动剂、抑制剂对肾癌细胞耐药性影响

　　以MTT法，将两种细胞分别接种96孔细胞培养板，37℃孵育12 h后，分为2组。取一组细胞先以10 nmol/L PMA或10 nmol/L Calphostin C预作用2 h，PBS轻洗3次后，更换含ADM的培养液;另一组直接更换ADM液。ADM梯度浓度为0.1、10、30、100、300、nmol/L，1、3、10、30、100、300 μmol/L，每孔100 μl，每个浓度设3复孔，对照只加培养液;37℃孵育36 h后，加入MTT，37℃孵育4 h，更换DMSO，37℃孵育4 h后，酶标仪540 nm读取光密度值(OD)，采用PRISM软件计算IC50。

　　1.3 统计学分析

　　采用PRISM软件及Student′s t检验。

　　2 结果

　　2.1 pcDNADEST47PKCαGFP表达载体对7860细胞的转染和鉴定

　　见图1。转染载体24 h后，荧光倒置显微镜观察绿色荧光蛋白的即时表达。第4周时出现大量转染细胞，传代扩增并命名为PKCα/7860。

　　2.2 PKCα基因RTPCR结果

　　见图2。总RNA经变性琼脂糖凝胶电泳见28S、18S rRNA条带清晰,紫外分光光度计测定A260/280均大于1.9。在RNA相同量的条件下,βactin的扩增条带基本相同;而7860与PKCα/7860细胞扩增PKCα片段(2 245 bp)条带出现明显差异，PKCα/7860细胞扩增条带十分明显，7860细胞则未出现条带。

　　2.3 PKCα激动剂、抑制剂作用后MDR1基因变化

　　见图3。在βactin扩增条带基本相同的情况下，PMA处理的PKCα/7860细胞MDR1含量最高，与无干扰因素下的PKCα/7860细胞相比，Calphostin C 处理的PKCα/7860细胞MDR1含量明显下降。

　　2.4 细胞内ADM浓度的测定

　　PMA、Calphostin C预处理后，PKCα/7860细胞中〔14C〕ADM浓度分别为130 nmol/L、716 nmol/L，未预处理的PKCα/7860细胞中〔14C〕ADM浓度为315 nmol/L,Calphotin C作用后，PKCα/7860细胞中的浓度为PMA作用后的5.8倍，此结果与MDR1基因变化相一致。

　　2.5 PKCα 激动剂、抑制剂对肾癌细胞生长抑制影响

　　见图4。Calphostin C协同ADM对肾癌细胞具有较强的抑制作用，且这种抑制作用随Calphostin C浓度增加而增大，呈浓度依赖关系。对肾癌PKCα/7860细胞的抑制率最低为13.9%，最高为59.6%。相比之下，PMA处理后的细胞存活率比未加干扰因素的PKCα/7860多32.7%。

　　2.6 PKCα 激动剂、抑制剂对肾癌细胞耐药性影响

　　转染后PKCα/7860对ADM的IC50〔1.658 8e-6(1.162 1e-6～2.367 7e-6)〕是7860〔7.801 5e-7(5.704 6e-7 ～ 1.066 9e-6)〕的2.13倍(P<0.01);而给予PKC特异性激活剂PMA的PKCα/7860的IC50〔2.679 4e-6(2.0521e-6 ～3.498 3e-6)〕增加了1.62倍(P<0.05);当给予PKCα抑制剂Calphostin C时，PKCα/7860对ADM的IC50〔9.2506e-8(5.933 7e-8～1.442 2e-7)〕则下降17.93倍(P<0.01)，与7860相比下降了8.43 倍(P<0.01)。 说明PKCα cDNA的转染可以提高7860细胞的耐药性，而PKCα的选择性激动剂和选择性抑制剂则分别可以增加和逆转肾癌细胞对ADM的耐药性。

　　3 讨 论

　　正常细胞生理状态下，PKC参与调控细胞周期，并对细胞生长与凋亡有调节作用。为保持细胞间功能的协调，机体常通过内源性机制使其活性下调，PKC被激活后活性下调的现象称为的“PKC的限制性调节”〔4〕，异常持续的PKC激活可导致细胞功能失调。因此在肿瘤细胞中，PKC的过度表达或异常激活阻断了“PKC的限制性调节”的调节方式，导致细胞生长紊乱并且触发肿瘤的形成。本课题组前期工作已经证明，肾癌组织中PKCα的阳性表达随病理分期分级增加而显著升高，PKCα可能与肾癌的恶性程度及侵袭性相关〔2〕。

　　研究提示，MDR1在其内源性耐药过程中起重要作用。其产物Pgp发挥药物泵功能将药物泵出细胞膜外产生耐药〔5〕。活化PKcα可以提高MDR1基因启动子活性，导致肿瘤细胞出现多药耐药〔6，7〕。肾癌组织出现MDR是化疗失败的主要原因之一，因此PKC抑制剂被联想到潜在的逆转肿瘤细胞内源性MDR的作用〔8〕。

　　肾癌内源性ADM耐药的主要表现为肾癌细胞内ADM浓度不足〔9〕，本研究的假设基于PKCα调控MDR1水平及其活性是肾癌细胞内源性ADM耐药发生变化的重要决定因素。因此，应用脂质体Lipofectamine2000将含PKCα基因的真核表达载体pcDNADEST47PKCαGFP导入肾癌7860细胞中，经G418筛选后，获得了具有G418抗性的细胞克隆，体外扩大培养出PKCα高表达肾癌细胞株PKCα/7860，鉴定结果显示PKCα/7860细胞呈PKCα的过表达状态。荧光倒置显微镜观察也证明整合于PKCα基因同一载体的绿色荧光蛋白显著表达，提示MDR1的翻译产物Pgp蛋白的大量存在。进一步的研究发现，PKCα活化状态下(PMA处理)PKCα/7860细胞MDR1含量明显高于PKCα抑制状态下细胞(Calphostin C处理)。与其相一致的是，Calphostin C抑制PKCα活性的同时，也抑制了PKCα/7860细胞的生长。这种抑制能力与Calphostin C的浓度呈剂量依赖性关系。为了研究Calphostin C抑制肾癌细胞生长能力的原因，测定了〔14C〕CADM在PKCα抑制或激活状态下的PKCα/7860细胞内含量，结果发现PKCα抑制状态下细胞(Calphostin C处理)内的〔14C〕CADM浓度要大大高于PKCα激活状态。

　　本实验说明，利用PMA提高了ADM耐药性同时降低细胞内ADM的聚集，其途径可能是PMA增加了MDR1的表达，进而提高了Pgp的含量，使得肾癌细胞将化疗药物转运至细胞外的能力激增，与之相反，PKCα抑制剂Calphostin C减少了细胞内MDR1表达的同时增加了肾癌细胞内ADM的浓度，并抑制了细胞生长增殖，其抑制肾癌细胞生长的机制是通过影响细胞内化疗药物的浓度来实现的。

　　以上结果解释了PKC过表达的细胞中ADM聚集障碍的现象，同时也支持PKC活性是决定细胞内源性ADM耐药变化的重要因素之一。然而，本文结果不能完全排除PKC调节的MDR过程受其他信号途径影响的可能，更进一步的机制有待于深入研究。

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