Cyr61在前列腺增生症患者膀胱壁中的表达及意义

　　作者：朱海涛 作者单位：徐州医学院附属医院泌尿外科，江苏徐州221002

　　【摘要】 目的 探讨富半胱氨酸肝素结合蛋白61(Cyr61)在良性前列腺增生症(BPH)患者膀胱壁组织中的表达，评价Cyr61的表达和膀胱出口梗阻所致的膀胱壁纤维化之间的关系。方法 分别留取BPH患者膀胱壁标本25例(BPH组)和非前列腺增生症且不伴有膀胱出口梗阻者膀胱壁标本19例(对照组)，通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和图像半定量分析，检测组织中Cyr61基因表达水平。结果 BPH组膀胱壁组织中Cyr61 mRNA指数明显高于对照组(1.70±0.46 vs. 0.61±0.26，P<0.01)。结论 Cyr61在BPH患者的膀胱壁组织中表达明显增高，可能是其纤维化的重要促进因素。

　　【关键词】 前列腺增生症 富半胱氨酸肝素结合蛋白61 膀胱出口梗阻

　　The expression of Cyr61 in the bladder wall of benign prostatic hyperplasia

　　ZHU Haitao1, WANG Yanhu1, WEN Rumin1, SUN Xiaoqing1, ZHANG Xiaodong2

　　(1.Department of Urology, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002, China;

　　2.Department of Urology, Beijing Chaoyang Hospital, Capital Medical University, Beijing 100020)

　　Abstract: Objective To investigate the expression of cysteine-rich protein 61 (Cyr61) in the bladder wall of benign prostatic hyperplasia (BPH) and to evaluate the relationship between Cyr61 gene expression and the fibrosis of bladder wall due to bladder outlet obstruction. Methods 25 samples of urinary bladder wall from BPH patients (BPH group) and 19 samples from subjects without BPH and bladder outlet obstruction (control group) were obtained for expression level detection of Cyr61 in bladder wall by the reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and image semi-quantitative analysis. Results The Cyr61 mRNA index in bladder wall in BPH group was significantly higher than that in control group (1.70±0.46 vs. 0.61±0.26, P<0.01). Conclusion Cyr61 expression is significantly increased in the tissues of urinary bladder wall in BPH patients, which may contribute to the fibrosis of bladder wall in BPH and shed new light on the safe and effective therapy of BPH.

　　Key words: prostatic hyperplasia; cysteine-rich protein 61; bladder outlet obstruction

　　良性前列腺增生症(benign prostatic hyperplasia,BPH)的危害主要表现为膀胱出口梗阻(bladder outlet obstruction, BOO)，最后导致膀胱逼尿肌纤维化、膀胱结构和功能受损。富半胱氨酸肝素结合蛋白61(cysteine-rich protein 61, Cyr61)是CCN家族(CTGF、Cyr61和Nov等简称CCN家族)成员之一，属于生长因子诱导的即刻早期基因，具有明显的促有丝分裂和趋化活性，都具有诱导成纤维细胞增殖和分泌细胞外基质等功能。本研究旨在探讨Cyr61对BPH导致BOO后膀胱组织结构的影响，以求了解BOO所致膀胱功能障碍的机制及其预防。

　　1 资料和方法

　　1.1 标本来源及分组 标本均来自徐州医学院附属医院泌尿外科同期住院行膀胱手术的病例,诊断均经手术及病理证实。其中BPH组25例，年龄51～79岁，平均67.4岁。对照组为非前列腺增生症且不伴有膀胱出口梗阻患者19例，其中膀胱肿瘤15例，膀胱外伤3例，后尿道断裂1例。年龄35～75岁，平均60.1岁。标本置于液氮中速冻，6 h后转移至-80℃冰箱保存。

　　1.2 主要试剂和仪器 Trizol分离液(自南京凯基公司)， RT-PCR试剂盒(MBI公司)，PCR仪(美国MJ公司),UVP医学图像分析仪(美国UVP Inc公司)，低温离心机(德国Eppendorf公司)。

　　1.3 引物设计与合成 根据人Cyr61、β-actin mRNA序列设计PCR 引物,使用Primer公司的Premier 5.0软件辅助设计, 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。RT-PCR引物序列见表1。

　　1.4 实验方法 ①总RNA 的提取：用电子天平称量100 mg冰冻组织，加入预冷的Trizol,匀浆器中充分匀浆, 提取总RNA,-80℃冷冻保存备用。②逆转录合成cDNA的第一链:按试剂盒说明书进行,以Oligo(dT)为引物，总反应体积为20 μl。③PCR 反应:取逆转录产物作为模板，按照试剂盒说明书，在PCR循环仪中反应。内参照为β-actin,预期扩增片段长度Cyr61为100 bp,β-actin为294 bp。④PCR 产物鉴定及定量分析:取PCR反应产物行2%琼脂糖凝胶电泳,在UVP凝胶成像系统下观察。以目的基因mRNA 扩增量/内参照β-actin 扩增量表示组织中目的基因 mRNA的相对表达水平。

　　1.5 统计学处理 实验所得数据用SPSS 13.0软件进行分析,以±s表示。组间比较采用t检验,P<0.01为差异有统计学意义。表1 RT-PCR引物序列

　　2 结 果

　　2.1 Cyr61 mRNA在膀胱组织中的表达情况 见表2。结果显示，BPH组Cyr61 mRNA的表达明显高于对照组(P<0.01)。

　　2.2 电泳结果 各组标本电泳后在100 bp及294 bp位置上各出现一特异性条带, 与预期扩增片段长度相符(图1), 提示为特异性的Cyr61和β-actin。对基因表达程度进行定量分析后显示,Cyr61 mRNA与β-actin 比值在BPH组和对照组分别为1.70±0.46和0.61±0.26，Cyr61 mRNA在BPH组膀胱壁中表达量均较对照组显著增高(P<0.01)。 表2 Cyr61在BPH组和对照组中的表达

　　3 讨 论

　　BPH是老年男性常见疾病,Berry等[1]对1075例尸检前列腺进行研究，发现随着年龄增长BPH发生率逐渐增高。当前列腺增生引起BOO时，膀胱的储尿、排尿功能相应受到影响。BOO可使膀胱组织发生两个变化，即早期逼尿肌的肥大和增生，后期膀胱壁的纤维化，纤维组织代替了逼尿肌组织。Chaqour等[2]通过大鼠BOO的动物模型实验发现，部分BOO动物膀胱逼尿肌增生、肥厚，Cyr61和CTGF表达上调。王国民等[3]通过雄兔模型证实BOO导致逼尿肌功能障碍，逼尿肌功能变化与其形态学变化相关。Buttyan等[4]通过大鼠BOO的动物模型实验发现，β-转换生长因子、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)等多种生长因子参与这些组织的变化。体外实验也显示随着逼尿肌细胞机械张力的增高，包括结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)、Cyr61的几个生长因子的表达都增加[5]。Chaqour等[2]研究显示Cyr61表达的升高在BOO出现的24 h就比较明显。Cyr61是CCN家族成员之一，这个家族还包括CTGF、肾母细胞瘤过度表达基因(Nov)等。

　　Cyr61是CCN家族第一个被克隆出来的基因。早期实验证实小鼠肝部分切除诱导Cyr61基因的迅速表达，证实了损伤可引起Cyr61的转录激活，能够加快成纤维细胞和血管内皮细胞生长。Cyr61促进内皮细胞连接的同时,可以加快成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor， FGF)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)合成速度及移动,提高血小板的黏附性。Cyr61促进修复的作用与下列因素有关:①与肝素结合刺激成纤维细胞和内皮细胞的黏附、定位、趋化作用,诱导DNA合成;②增强基质金属蛋白酶-1(matrix metalloproteinase-1,MMP-1)和基质金属蛋白酶-3(matrix metalloproteinase-3，MMP-3)的表达[6],这些金属蛋白酶可作用于基质,促进伤口的愈合;③促进血小板的黏附性;④调控基因在血管形成和细胞外基质重构中的作用,包括VEGF-A、VEGF-C、Ⅰ型胶原;⑤介导成纤维细胞黏附,诱导细胞持久生成更多丝状和片状伪足,促进细胞伸展,在伪足边缘伴有整合素包含复合体的生成;⑥激活焦点黏附激酶(focal adhesion kinase, FAK),使焦点黏附相关调节蛋白(paxillin)磷酸化;⑦传递细胞黏附信号,促进细胞增殖。通过以上途径,Cyr61可以引起基质改变,参与损伤修复中肉芽组织生成[7]。

　　我们采用RT-PCR技术测定了2组膀胱标本中Cyr61的表达情况，结果显示在BPH组中Cyr61有较强表达。提示在受BOO影响后引起膀胱壁纤维化进程中，随着Cyr61转录过程的激活，启动了创伤修复和再生，刺激组织中成纤维细胞增殖和细胞外基质沉积。由于包括CTGF、Cyr61等的几个生长因子的表达，促使逼尿肌细胞间大量胶原纤维产生，导致膀胱纤维化的形成，细胞间隙增宽，紧密联接明显减少，有时还伴有肌细胞或神经轴突变性，以至影响细胞各自的收缩能力和细胞间的协同收缩能力，使整个逼尿肌不能产生协调一致、快速有力的收缩，最终导致膀胱结构和功能受损。

　　【参考文献】

　　[1] Berry SJ, Coffey DS, Walsh PC, et al. The development of human benign prostatic hyperplasia with age [J]. J Urol,1984,132(3)：474-478.

　　[2] Chaqour B, Whitbeck C, Han JS, et al. Cyr61 and CTGF are molecular markers of bladder wall remodeling after outlet obstruction [J]. Am J Physiol Endocrinol Metab,2002,283(4):E765-E774.

　　[3] 王国民,王 杭.雄性兔膀胱出口部分梗阻所致逼尿肌功能障碍的研究[J].中华实验外科杂志,2001,18(6):564-566.

　　[4] Buttyan R, Chen MW, Levin RM. Animal models of bladder outlet obstruction and molecular insights into the basis for the development of bladder dysfunction [J]. Eur Urol,1997,32(Suppl 1):32-39.

　　[5] Mirone V, Imbimbo C, Longo N, et al. The detrusor muscle: an innocent victim of bladder outlet obstruction [J]. Eur Urol,2007,51(1):57-66.

　　[6] Schober JM, Lau LF, Ugarova TP, et al. Identification of a novel integrin αMβ2 binding site in CCN1 (CYR61), a matricellular protein expressed in healing wounds and atherosclerotic lesions [J]. J Biol Chem,2003,278(28):25808-25815.

　　[7] 李 东，周 新，郑 方，等.Cyr61的研究进展[J].国外医学·临床生物化学与检验学分册，2005,26(7):424-426.