EZH2基因在肾透明细胞癌中的表达及其意义

　　作者：李海波，王禾，武国军 作者单位：1. 中国人民解放军第105医院，安徽合肥 230031;2. 第四军医大学西京医院泌尿外科，陕西西安 710032

　　【摘要】 目的 探讨EZH2(enhancer of zeste homolog 2, EZH2)基因在肾透明细胞癌中的表达及其临床意义。方法 采用免疫组织化学法分别检测正常肾脏组织(8例)及肾透明细胞癌标本(58例)中EZH2蛋白的表达。结果 正常肾脏组织与肾透明细胞癌标本EZH2蛋白表达率分别为12.5%(1/8)、74.1%(43/58)(P<0.05)。肾透明细胞癌标本中，局部进展性肾癌(Ⅲ)与转移性肾癌(Ⅳ)EZH2蛋白表达明显高于局限性肾癌(Ⅰ+Ⅱ)(P<0.05);高分化肾癌、中分化肾癌及低分化肾癌EZH2蛋白表达不具有显著性差异。结论 EZH2在肾透明细胞癌明显高表达，提示其与肾透明细胞癌的发生、发展密切相关，对于肾透明细胞癌的早期诊断及判断预后可能有重要的意义。

　　【关键词】 肾透明细胞癌;EZH2;基因表达;免疫组化

　　(1. The 105 Hospital of PLA, Hefei 230031; 2. Department of Urology,

　　Xijing Hospital of Fourth Military Medical University, Xian 710032, China)ABSTRACT: Objective To explore the expression of EZH2 in clear cell carcinoma and its significance. Methods EZH2 protein expression was assessed by immunohistochemical method in tissue specimens of normal nephridium and clear cell carcinoma. Results The rate of EZH2 protein expression was 12.5% and 74.1% (P<0.05) in the normal nephridium group and the clear cell carcinoma group, respectively. EZH2 protein expression was increased in localized advanced renal cell carcinoma (Ⅲ) and metastatic renal cell carcinoma (Ⅳ) compared with localized renal cell carcinoma (Ⅰ+Ⅱ) (P<0.05). There were no significant differences in EZH2 protein expression levels among welldifferentiated renal cell carcinoma, moderately differentiated renal cell carcinoma and poorly differentiated renal cell carcinoma. Conclusion Our data show a significant increase in EZH2 expression in clear cell carcinoma compared with normal nephridial tissue, which suggests that increased EZH2 overexpression correlates with oncogenesis and development of clear cell carcinoma. EZH2 may play an important role in early diagnosis and prognosis for clear cell carcinoma.

　　KEY WORDS: clear cell carcinoma; EZH2; gene expression; immunohistochemistry

　　肾癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤，其中60%～85%为肾透明细胞癌(clear cell carcinoma)。肾癌发病原因复杂，与多种基因相关。EZH2(enhancer of zeste homolog 2, EZH2)基因是1996年发现的一种新的人类基因，与细胞生长调节有关。EZH2可抑制染色质结构中的靶基因，促进细胞增殖，其高表达刺激肿瘤细胞的扩散[1]，在多种肿瘤组织中高表达[27]。本研究探讨其在肾透明细胞癌中的表达情况及其意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本 实验中的58例肾透明细胞癌标本均来自于西安西京医院2005年8月至2007年8月肾癌手术的患者，其中男38例，女20例，年龄34～76岁，平均年龄57岁。所有病例均于术后病理证实为肾透明细胞癌。按AJCC肾癌的临床分期，Ⅰ期17例，Ⅱ期18例，Ⅲ期14例，Ⅳ期9例。8例正常肾脏组织来自非肿瘤原因行肾切除患者，其中男5例，女3例，年龄19～65岁，平均年龄35岁。

　　1.2 实验试剂和仪器 兔抗人EZH2多克隆抗体(美国Cell Signaling公司);生物素二抗、DAB显色系统(武汉博士德公司)，Leica Q570c真彩图像分析仪(德国Leica公司);Nikon Eclipse E1000采图摄像系统(日本Nikon公司)。

　　1.3 EZH2的免疫组化检测 标本经40g/L甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，4μm连续切片。石蜡切片常规脱蜡,梯度酒精至水，30mL/L H2O2室温灭活30min，微波抗原修复，正常山羊血清室温封闭30min，滴加兔抗人EZH2多克隆抗体(1∶200)后4℃过夜，滴加生物素二抗，DAB显色、脱水、透明、封片。用已知的阳性切片作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。用Nikon Eclipse E1000采图摄像系统进行照相。

　　1.4 阳性染色结果的判定 EZH2主要以细胞核内出现黄色、棕黄色、棕褐色颗粒为阳性显色。以同一显微镜倍数(×400)观察全片，随机选择5个高倍(×400)视野，合并计算所分析的5个不同视野着色细胞的百分率及细胞质的着色程度。根据染色程度及染色细胞的百分率进行分析评定：基本不着色为0分，着色淡为1分，着色较深为2分;着色细胞占计数细胞百分率：≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，≥51%为3分，以每张切片染色程度和染色细胞百分率得分相乘的积为最后得分。得0～1分者判为阴性(-)，得2分者判为弱阳性(+)，得3～4分者判为中等阳性()，得6分者判为强阳性()。

　　1.5 统计学分析 采用SPSS11.5统计软件，率的比较采用Fisher确切概率法，非参数检验采用KruscalWallis检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 免疫组织化学染色结果 正常肾脏组织中EZH2蛋白表达(1/8)，明显低于肾透明细胞癌组织(43/58)(P<0.05，表1、图1)。表1 EZH2在肾透明细胞癌和正常肾组织中的表达

　　2.2 EZH2表达与肾透明细胞癌患者临床病理特征之间的关系 利用非参数KruscalWallis检验对不同临床分期和病理分级的EZH2表达状况进行比较，可见局部进展性肾癌(Ⅲ)与转移性肾癌(Ⅳ)表达明显高于局限性肾癌(Ⅰ+Ⅱ)，具有显著性差异(P<0.05)，而4个临床分期和不同病理分级间的EZH2表达不具有显著性差异(表2)。表2 免疫组织化学分析EZH2表达与肾透明细胞癌患者临床病理特征之间的关系

　　3 讨 论

　　EZH2基因是1996年发现的一种新的人类基因，是果蝇zeste基因增强子的人类同源物，是PcG(polycomb group, PcG)基因家族的重要成员之一。在PcG基因家族中，EZH2起着核心作用。PcG和TrxG(trithorax group, TrxG)基因是广泛保守的防止细胞身份发生改变的细胞记忆系统的重要成分。EZH2具有组蛋白甲基转移酶、组蛋白去乙酰化酶(HDAC)和多种基因外的调控作用，参与转录抑制[8]。作为转录阻遏因子，EZH2能够减少转录因子与DNA结合，抑制靶基因的表达，并作用于pRb2/pl30蛋白碳末端与组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)相联的区域，恢复pRb2/pB0HDAC1复合物介导的细胞周期素A启动子的活性，最终促进细胞周期演进和恶性变[9]。近年的研究发现，EZH2在肾母细胞瘤、乳腺癌、直肠癌、前列腺癌、淋巴瘤、膀胱癌等恶性肿瘤中明显高表达[27,10]。其中EZH2在侵袭转移性前列腺癌[11]和乳腺癌[1213]中明显高表达;局限性前列腺癌、乳腺癌若高表达EZH2，则临床预后较差。

　　肾透明细胞癌是泌尿系统中常见的肿瘤之一。肾透明细胞癌的治疗以手术根治性切除为主要方法，放疗及化疗效果欠佳，免疫治疗效果不明确。由于早期没有特异性症状，发现时多为中晚期，造成治疗效果不理想。早期发现行手术根治对肾癌患者非常重要。因此，迫切需要发现特异、敏感的早期诊断、鉴别诊断和预后评估的因子。研究新的可用于诊断、治疗、判断预后、预测治疗效果的基因，可以为肾透明细胞癌的早期诊断和预后提供有效的实验依据。本研究结果显示,EZH2蛋白表达在肾透明细胞癌中明显高于正常组织，提示EZH2可能是肾透明细胞癌一个敏感的生物学标志。进一步分析发现局部进展性肾癌(Ⅲ)与转移性肾癌(Ⅳ)表达明显高于局限性肾癌(Ⅰ+Ⅱ)。说明EZH2的表达与肾透明细胞癌的临床分期密切相关，EZH2很可能成为早期诊断、预后以及治疗的一个新的靶分子。但不同病理分级(高分化、中分化、低分化)间的EZH2蛋白表达不具有显著性差异，可能是因为标本例数少或免疫组织化学的研究方法在表达量的计算方面不够敏感，无法在统计学上显示出差异来，这还需要其他方法进一步研究与证实。

　　综上所述，本研究结果提示EZH2的表达与肾透明细胞癌发生、发展密切相关，很可能成为一个新的生物学标志，在肾透明细胞癌的早期诊断、预后以及治疗中具有重要意义，需进一步深入研究。

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