肾癌组织中支原体DNA检测的临床意义

　　作者：曹军，李建平，程伟，陈琦 作者单位：西安交通大学医学院第二附属医院泌尿外科，陕西西安 710004

　　【摘要】目的 探讨肾癌的临床病理特征与支原体DNA的相关性。方法 选取本院肾癌石蜡包埋标本95例，采用支原体通用引物的巢式多聚酶链反应技术检测肾癌组织中的支原体DNA。 结果 肾癌组织中的支原体DNA阳性率为81.1%;中、低分化肾癌组织中的支原体DNA阳性率(90.9%)高于高分化肾癌组织(72.6%) (P<0.05);中、晚期肾癌组织中的支原体DNA阳性率(92.9%)高于早期肾癌组织(71.7%)(P<0.01);支原体DNA阳性患者的3、5年生存率(57.9%、37.5%)低于支原体DNA阴性患者(89.7%、81.8%)(P<0.01)。结论 支原体DNA阳性率与肾癌病理分级和临床分期密切相关，支原体感染可能会影响肾癌的生物学行为及预后。

　　【关键词】 支原体感染;肾癌;巢式多聚酶链反应

　　Clinical significance of detection of mycoplasma DNA in renal cell carcinoma

　　Cao Jun, Li Jianping, Cheng Wei, Chen Qi

　　(Department of Urology, the Second Affiliated Hospital,

　　Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710004, China)

　　ABSTRACT: Objective To investigate the association between mycoplasma DNA and renal cell carcinoma (RCC). Methods There were 95 samples of archived embedded tissues of RCC. We detected mycoplasma DNA in the tissues by nested polymerase chain reaction (PCR) with mycoplasma universal primer. Results The mycoplasma DNA detection ratio in RCC samples was 81.1%. The samples with moderate and low differentiation had a higher mycoplasma DNA ratio (90.9%) compared with that of high differentiation samples (72.6%) (P<0.05). Mycoplasma DNA was more frequently detected (92.9%) in advanced tumor samples compared with localized RCC samples (71.7%), with significant differences between the frequencies (P<0.01). The 3, 5 years survival rate (57.9%, 37.5%) of the positive mycoplasma DNA cases was significantly lower than that (89.7%, 81.8%) of the negative mycoplasma DNA cases (P<0.01). Conclusion The positive ratio of mycoplasma DNA in RCC significantly is related to pathological grade and clinical stage. Mycoplasma infection has an effect on the biological behavior of RCC. Mycoplasma DNA plays a certain role in the development of RCC and could be used as a predictor of prognosis of RCC.

　　KEY WORDS: mycoplasma; infection; renal cell carcinoma; nested polymerase chain reaction (PCR)

　　支原体慢性持续性感染能引起细胞多阶段恶性转化和上调癌基因的表达，并引起细胞生物学行为改变，提示支原体感染与肿瘤的发生有潜在的相关性[16]。目前，对于支原体感染与胃肠道肿瘤、卵巢肿瘤的关系已有较多报道，但关于其对肾癌的生物学致病作用鲜有报道。本研究通过巢式多聚酶链反应技术检测肾癌组织中的支原体DNA，探讨支原体感染与肾癌的关系。

　　1 资料与方法

　　1.1 临床资料

　　选取本院1990年至2005年间肾癌石蜡包埋标本95例。其中男性69例，女性26例;年龄24-79岁，平均62.5岁。按肿瘤细胞类型分为透明细胞癌60例、乳头状肾细胞癌15例、嫌色细胞癌20例。肿瘤细胞的分化程度按Fuhrmans病理分级[7]，包括Ⅰ级51例、Ⅱ级31例、Ⅲ级13例;按TNM分期标准，分为Ⅰ期21例、Ⅱ期32例、Ⅲ期33例、Ⅳ期9例。随访3年以上者67例，5年以上者59例，随访时间2-13年。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 主要试剂

　　Buffer缓冲液、MgCl2、dNTP、Taq酶(日本TaKaRa公司)，DNA Marker(北京天为时代科技有限公司)，琼脂糖为Spanish分装;酚氯仿抽提液(中国医学科学院生物医学工程研究所)，组织细胞裂解液、蛋白酶K(上海生工公司)。

　　1.2.2 支原体阳性对照菌株

　　支原体阳性对照菌株为支原体混合菌株，包括解脲脲原体、人型支原体、肺炎支原体、生殖支原体、发酵支原体、穿透支原体、梨支原体、关节炎支原体、猪鼻支原体、精氨酸支原体、口腔支原体和唾液支原体，由中国医学科学院医学生物学研究所提供。

　　1.2.3 支原体通用引物的设计和合成

　　登录PubMed，检索GenBank核酸数据库中已登录各种支原体科微生物16srDNA基因和23srDNA基因序列，以及两种rDNA之间的间隔区核酸序列进行了比较，从中选择了两段高度重复的核酸序列，经PCRDESN分析合格后作为支原体通用引物[2, 8]，由美国HyClone & Pierce实验室合成。

　　外部引物：F1: 5′ACCATGGGAGCTGGTAAT3′，R1: 5′CTTCTCGACTTCCAGACCCAAGGCAT3′;内部引物：F2: 5′GTGCGGATGGATCACCTCCT3′，R2:5′GCATCCACCAAAAACCCTT3′。

　　1.2.4 巢式PCR检测

　　①肾癌标本中DNA的提取：从蜡块切取10μm切片5片，置入1.5mL Eppendorf管内，二甲苯脱蜡，95%-50%(体积分数)乙醇梯度水化，常规组织细胞裂解液、蛋白酶K消化，酚氯仿抽取DNA，Tris盐酸缓冲液(TE)溶解保存。②巢式PCR扩增：取模板5μL，每对引物各2μL(1mol/L)，dNTP 6μL(200mol/L)，10×Buffer缓冲液5μL，去离子三蒸水27μL，置FR800型基因扩增仪，93℃预变性2min后于80℃时加Taq DNA聚合酶1μL，此时总反应体积为50μL。热循环参数：预变性93℃ 2min，然后按93℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，共循环35周期，最后72℃延长至2min[910]。外套通用扩增和内套特异扩增参数均相同。③琼脂糖凝胶电泳检测：电泳电压140V、30min，紫外检测仪观察结果，凝胶数字成像系统拍照。

　　1.3 结果判断

　　以支原体阳性对照菌株为阳性对照，以去离子三蒸水为阴性对照。观察巢式PCR凝胶电泳结果，扩增产物在280bp处出现特异性扩增条带，视为支原体DNA阳性[10]。如结果为阴性，则取备份标本，重复以上实验步骤，再次进行巢式PCR检测，两次均为阴性结果定为阴性，任一次出现特异性阳性条带定为阳性。

　　1.4 统计学处理

　　应用SPSS11.0软件包对实验数据进行χ2检验、Fishers确切概率检验及相关性分析，检验显著性水准为：α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 肾癌组织中的支原体DNA的阳性率

　　在巢式PCR凝胶成像电泳图上支原体DNA阳性表达，为280bp处出现特异性扩增条带(图1)。95例肾癌组织标本中，支原体DNA阳性表达77例，阴性表达18例，阳性率为81.1%。

　　2.2 不同病理分级肾癌组织中支原体DNA的阳性率

　　Fuhrmans病理分级Ⅰ级(高分化)肾癌组织中的支原体DNA的阳性率为72.6%(37/51);Ⅱ-Ⅲ级(中、低分化)肾癌组织中DNA的阳性率为90.9%(40/44)，两者相比差异具有统计学意义(P<0.05)。

　　2.3 不同临床分期肾癌组织中支原体DNA的阳性率

　　早期肾癌(Ⅰ-Ⅱ期)组织中支原体DNA的阳性率为71.7%(38/53);中晚期肾癌(III-IV期)组织支原体DNA的阳性率为92.9%(39/42)，两者相比差异具有统计学意义(P<0.01)。

　　2.4 支原体DNA表达与肾癌患者3、5年生存率的关系

　　在获随访的肾癌病例中，支原体DNA阳性患者的3、5年生存率分别为57.9%(22/38)和37.5%(18/48);支原体DNA阴性患者的3、5年生存率分别为89.7%(26/29)和81.8%(9/11);支原体DNA阳性患者的3、5年生存率均显著低于支原体DNA阴性患者组，差异均具有统计学意义(P<0.01)。

　　3 讨 论

　　支原体与恶性肿瘤的相关研究最早开始于20世纪60年代，在白血病患者的骨髓和淋巴组织中分离到支原体。随着分子生物学技术的发展，在人类的一些实体瘤中相继发现有支原体的存在，支原体感染与人类的瘤样病变或恶性肿瘤存在潜在的相关性[16]。

　　PCR方法灵敏、特异、简便快速，巢式PCR由于采用内外两对引物分二轮扩增，因此其灵敏度和特异性更高，已为国内外支原体研究者普遍使用[2, 8, 11]。本实验采用巢式PCR技术，使用15种支原体通用引物，从基因水平检测95例肾癌组织中的支原体DNA，结果显示在肾癌组织中的支原体DNA阳性率高达81.1%。该结果与Huang等[9]对食道癌、胃癌、肺癌等多种肿瘤组织进行的支原体DNA检测结果相似，也与Mustafa[11]的研究结果相符合。提示支原体DNA在肾癌组织中存在着稳定的表达，从基因水平证明了支原体感染与人类肾癌的发生可能存在相关性。

　　Zhang等[5]认为支原体在促进细胞增殖方面可能发挥重要作用，发现感染了支原体的细胞比未感染的细胞在体内有更强的转移能力。支原体通过调节肿瘤细胞周期，导致肿瘤细胞侵袭力增强，影响肿瘤的发生、发展过程。本研究结果发现，在不同病理分级的肾癌组织中，支原体DNA阳性率随着肿瘤的病理分级增高而增高，中、低分化肾癌组织中的支原体DNA阳性率为90.9%，高分化肾癌组织中的支原体DNA阳性率为72.6%，两者差异有统计学意义，表明支原体感染与肿瘤细胞分化程度密切相关。Huang等[9]采用PD4免疫组化技术对胃癌、结肠癌不同分化程度的肿瘤组织进行检测的结果与改用PCR方法检测所得结果一致。这与我们的研究情况相符合。同时本研究也发现，支原体DNA的阳性率还随着肾癌临床分期的升高而增加，早期肾癌组织中的支原体DNA阳性率为71.7%，中、晚期肾癌组织中的阳性率为92.9%，两者差异具有显著统计学意义。提示支原体感染可能与肾癌的侵袭转移有关，检测肾癌组织中支原体感染，可能成为预测肿瘤侵袭性的一个新的指标。

　　肾癌生物学行为及预后难以预测,给临床治疗带来一定的困难。目前，用以评估预后的依据有临床分期和病理分级,但均存在一定缺陷。临床分期对晚期病例判断较为准确，而对那些早期预后不良者判断较困难。病理分级是以光镜下细胞组织形态学改变为依据，易受主客观因素影响，可重复性差，难以准确判断预后。近年来有学者用流式细胞计数判断肾癌预后，取得一定成绩,但因对肾癌不能定位诊断，实体瘤分离易受诸多因素影响，且设备昂贵，故难以广泛应用。我们通过对95例肾癌患者随访，结果表明支原体DNA阳性患者的3、5年生存率低于支原体DNA阴性病例，支原体DNA阳性和阴性的肾癌患者3、5年生存率具有显著差异。表明支原体在肾癌组织中的慢性、持续性感染可能会影响肾癌患者的预后。

　　Gerlic等[12]认为支原体能诱导肿瘤坏死因子α(TNFα)的产生。TNFα是微生物感染所诱导的细胞因子中最重要的一种内源性促癌剂，具有生长因子样作用，可促进Cmyc和Cfos等与细胞增殖密切相关的原癌基因的表达，TNFα与肿瘤的发生和转移密切相关。Chen 等[4]研究发现支原体介导的细胞转化是一个多阶段、多步骤的积累过程，一般要经历正常细胞→可逆性转化→不可逆性恶性转化。这与人类肿瘤的发生过程有着相似的特点。因此，认为支原体的表达强度可作为判断肿瘤恶性程度的一个指标。

　　综上所述，支原体感染与肾癌病理分级和临床分期密切相关，支原体感染可能会影响肾癌的生物学行为及预后。由于支原体的分型极为复杂，要真正阐明支原体感染与肿瘤发生的关系及相关分子机制，尚有大量的工作要做。

　　【参考文献】

　　[1]宁金鹰，寿成超. 支原体感染与肿瘤 [J]. 癌症, 2004, 23(5):602604.

　　[2]Kwon HJ, Kang JO, Cho SH, et al. Presence of human mycoplasma DNA in gastric tissue samples from Korean chronic gastritis patients [J]. Cancer Sci, 2004, 95(4):311315.

　　[3]李秀云，张帝开. 支原体感染与肿瘤发生的研究进展 [J]. 中国实用妇科与产科杂志, 2005, 21(11):691693.

　　[4]Chen XC, Chang LJ. Mycoplasmamediated alterations of in vitro generation and functions of human dendritic cells [J]. J Biom Sci, 2005, 12(1):3146.

　　[5]Zhang SM, Tsai S, Lo SC. Alteration of gene expression profiles during mycoplasmainduced malignant cell transformation [J]. BMC Cancer, 2006, 5(6):116.

　　[6]Liu WB, Zhang JZ, Jiang BH, et al. Lipoprotein p37 from mycoplasma hyorhinis inhibiting mammalian cell adhesion [J]. J Biom Sci, 2006, 13(3):323331.

　　[7]吴永安. 肾细胞癌分类、分级、分期现状和预后因素 [J]. 医师进修杂志, 2005, 28(2):14.

　　[8]李彦明，张映. 套式PCR在支原体检测中的应用 [J]. 中国预防兽医学报, 2005, 27(3):237240.

　　[9]Huang S, Li JY, Wu J, et al. Mycoplasma infections and different human carcinomas [J]. World J Gastroenterol, 2001, 7(2):266269.

　　[10]马华崇，马泓，张艳丽，等. 胃癌组织中猪鼻支原体的分离培养与鉴定 [J]. 中国人兽共患病杂志, 2003, 19(2):3133.

　　[11]Pehlivan M, Pehlivan S, Onay H, et al. Can mycoplasmamediated oncogenesis be responsible for formation of conventional renal cell carcinoma? [J]. Urology, 2005, 65(2):411414.

　　[12]Gerlic M, Horowitz J, Farkash S, et al. The inhibitory effect of mycoplasma fermentans on tumour necrosis factor (TNF)alphainduced apoptosis resides in the membrane lipoproteins [J]. Cell Microbiol, 2007, 9(1):142153.