反复自然流产与精子DNA完整性的相关性研究

 作者：吴大鹏，吴齐飞，李旭东   

作者单位：西安交通大学医学院第一附属医院泌尿外科，陕西西安 710061

  【摘要】  目的 探讨反复自然流产与精子DNA完整性的相关性。方法 按纳入标准将研究对象分成反复自然流产患者丈夫组(n=58)和正常生育男性对照组(n=50)，采用吖啶橙实验(AOT)对研究对象精子DNA完整性进行检测，并对研究对象精液进行常规分析。结果 两组研究对象年龄、吸烟史、饮酒史无统计学差异(P>0.05)；反复自然流产患者丈夫组精液的精子密度、精子活力显著低于正常生育对照组(P<0.05)；反复自然流产患者丈夫组精子DNA的完整性低于正常生育对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 精子DNA完整性损伤是反复自然流产的可能原因，精子DNA完整性损伤导致反复自然流产的致病机理尚需进一步研究。

【关键词】  反复自然流产；精子；DNA

     反复自然流产(recurrent spontaneous abortion, RSA)的发生率为1%-5%，其发病机制尚未完全阐明，可能与解剖异常、免疫失调、内分泌紊乱、染色体异常、感染及基因多态性等有关，由于其发病原因不明，给临床治疗带来困难［1-4］。

    精子DNA是精子遗传物质的载体，近年来的研究表明精子DNA的完整性能够影响精子的受精能力、受精卵的分裂以及胚胎的发育［5-7］。为了评估精子DNA完整性在反复自然流产中的可能作用，我们对反复自然流产患者丈夫精子DNA完整性和正常生育男性精子DNA完整性进行了检测，并比较了两组间在精子DNA完整性和精液常规方面的差异。

    1  对象与方法

    1.1  研究对象  本组58例反复自然流产患者丈夫(反复自然流产组)，年龄25-36岁，来自西安交通大学医学院第一附属医院男科门诊；50例正常生育男性自愿者作为对照组(正常对照组)，年龄24-33岁，其配偶至少有一次生育史且无自然流产史。反复自然流产患者的纳入标准参照Buchholz等［8］的标准。对研究对象的年龄、饮酒史、吸烟史等基本资料进行统计，以平均每日吸烟超过10支，连续吸烟6个月及以上为吸烟，以平均每日饮酒量50 mL(纯乙醇量)，连续6个月及以上为饮酒。

    1.2  主要试剂与仪器  WLJY-9000伟力彩色精子质量检测系统(北京伟力新世纪科技发展有限公司)，荧光倒置显微镜(日本Olympus公司)，吖啶橙(美国Sigma公司)。

    1.3  标本采集  受检者应禁欲3-7 d，用手淫或体外排精法收集一次排精的全部精液，留于清洁收集器皿内，标明采集时间，置37 ℃培养箱内，液化后进行精液常规分析。

    1.4  精液分析  采用国产WLJY-9000伟力彩色精子质量检测系统软件配合载物台温控仪以及计算机操作，参照《WHO人类精液及精子-宫颈黏液相互作用实验室检验手册》［9］对精子密度、精子活力和精子活力分级进行分析。

    1.5  精子DNA完整性检测  采用吖啶橙实验(acridine orange test, AOT)染色对精子DNA完整性检测［10］。将液化后精子进行精液分离，1 500 r/min离心10 min，去除精浆，以37 ℃ 0.01 mol/L PBS液洗涤沉淀3次，将精子制备为精子悬液，然后将精子悬液涂片，风干后以Carnoy液(3份甲醛与1份冰醋酸混合)固定过夜；固定后的精子涂片以吖啶橙染液染色5 min，蒸馏水洗片3次，风干后行荧光显微镜检(放大400倍，激发波长为460 nm)。为了保证检测结果的可靠性，染色后的精子涂片须立即观察，防止荧光淬灭。经染色后，正常精子DNA呈双链在激发光下呈绿色，而变性或受损的精子DNA则断裂为单链呈黄色或红色。在荧光显微镜光镜同一视野下随机计数200个精子，以异常精子所占的百分比来表示精子DNA受损程度。

  1.6  统计学分析  采用SPSS13.0进行数据处理，计数资料以x±s表示，组间比较采用t检验和χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

    2  结    果

    2.1  研究对象基本情况  对研究对象基本资料进行统计，以平均每日吸烟超过10支、连续吸烟6个月及以上为吸烟，以平均每日饮酒量50 mL(纯乙醇量)，连续6个月及以上为饮酒。两组患者在年龄、饮酒史、吸烟史等方面无统计学差异(P>0.05，表1)。 表1  研究对象的基本状况

    2.2  精子活力检测结果  反复自然流产组和正常生育对照组精子密度及活力检测结果见表2。

    2.3  精子DNA完整性检测结果  反复自然流产组和正常生育对照组精子DNA受损程度分别为(75.4±7.5)%和(30.2±5.8)%，两组间差异有统计学意义(P<0.05)。表2  反复自然流产组和正常生育对照组精子密度及活力

    3  讨    论

    反复自然流产是妇产科常见病。近年来的研究表明其可能与解剖异常、免疫失调、内分泌紊乱、染色体异常、感染及基因多态性等有关，但是其确切病因尚不清楚。

    常规的精液分析能够从精子密度、精子活力和精子形态等方面反映精液质量，但是其在精子功能的评价方面价值有限，不能直接反映精子受精能力和对胚胎发育的影响。近年来的研究表明精子DNA的完整性与精子活力、精子形态及精子功能有显著相关性，并且可以影响受精卵的分裂以及胚胎的发育［5-7］。精子DNA是遗传信息的载体，精子DNA的完整性对种族的繁衍具有重要意义，但是精子生成过程中染色质的浓缩异常、受损精原细胞的凋亡异常、环境毒物以及不良的生活习惯都会造成精子DNA损伤。

    吖啶橙是一种荧光络黄染料，具有高度的异染性，吖啶橙以插入的方式与双螺旋的DNA分子结合；在激发波照射情况下，当与双链DNA结合时呈单体形式发出绿色荧光，与单链DNA结合时呈聚合物形式发出红色或黄色荧光［11］。而精子DNA损伤的特征性改变为精子DNA单链形成和双链断裂［12］，所以吖啶橙实验被用来检测精子DNA损伤。精子经吖啶橙染色后，可以采用荧光显微镜检或流式细胞仪对染色结果进行判定，由于荧光显微镜检操作简单和经济而被广泛使用［13］。

    本研究为了探讨精子DNA完整性在反复自然流产中的可能作用，对反复自然流产患者丈夫和正常生育对照男性精子DNA完整性进行了检测，并对研究对象精液进行了常规分析。研究结果表明反复自然流产组精子DNA完整性显著低于正常对照组，而且反复自然流产组精子密度和精子活力也显著低于正常对照组，但是精子DNA完整性受损是否是导致精子密度和精子活力下降的原因尚不清楚。

    综上所述，精子DNA完整性与反复流产有显著的相关性，并且反复自然流产患者丈夫精液常规存在异常。然而，精子DNA完整性损伤导致反复流产的致病机理尚需进一步研究。

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［9］世界卫生组织. WHO人类精液及精子-宫颈黏液相互作用实验室检验手册 ［M］//谷翊群，陈振文，于和鸣，等译. 第4版. 北京：人民卫生出社, 2001:25;55.

［10］Liu DY, Clarke GN, Baker HW. Exposure of actin on the surface of the human sperm head during in vitro culture relates to sperm morphology, capacitation and zona binding ［J］. Hum Reprod, 2005, 20(4):999-1005.

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