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《泌尿生殖系外科学》

茶多酚诱导膀胱癌T24细胞凋亡及上调PTEN表达

发表时间:2009-07-02  浏览次数:738次

 作者:应荣彪,瞿海江,姚 俊,胡 哲,黄海涛   

作者单位:温岭市第二人民医院肿瘤外科,浙江温岭 317502

 【摘要】  目的 探讨茶多酚(TP)抑制膀胱癌细胞生长的可能分子机制。方法 采用MTT法和流式细胞术,观察膀胱癌细胞系T24经不同浓度TP处理后细胞生长及PTEN蛋白表达的改变。结果 TP以剂量依赖的方式抑制膀胱癌细胞的生长,加入0、50、100、200、400 μg/mL TP的T24细胞抑制率分别为0%、11.2%、33.4%、36.9%、67.5%。流式细胞仪直方图上可见亚二倍体峰,癌细胞出现凋亡,凋亡率分别为6.8%、25.1%、28.6%、36.6%、41.1%;同时,随TP作用浓度的增加,G1/S阻滞细胞逐渐增多,细胞分裂增殖指数(PI)降低;而细胞PTEN蛋白表达水平由(37.66±0.49)逐渐增加至(163.92±3.36)(P<0.01)。结论 TP对T24细胞生长具有抑制作用,其机制可能是通过上调PTEN 蛋白表达影响细胞周期和诱导细胞凋亡。

【关键词】  茶多酚;膀胱癌;凋亡;PTEN蛋白

    茶多酚(TP)是茶叶中最具有抗肿瘤活性的酚类化合物。研究发现,茶及TP能抑制膀胱癌发生和发展[1-2]。本实验用TP作用于体外培养的膀胱癌T24细胞株,观察TP对膀胱癌T24细胞株生长及其PTEN蛋白表达水平的影响,探讨TP抑制肿瘤细胞株生长的可能分子机制。

    1  材料与方法

    1.1  材料  T24细胞株,购自中国科学院上海细胞生化研究所;TP购自中国茶叶研究所;鼠抗人PTEN为美国MBI公司产品,RPMI1640培养液、四甲基偶氮唑盐(MTT)、0.25%胰蛋白酶为美国Sigma公司产品,羊抗鼠IgG为美国Zymed公司产品,10%小牛血清购自杭州四季青生物公司,硫氰酸荧光素(FITC)为北京金山生物有限公司产品,流式细胞仪为美国BD公司产品。

    1.2  方法

    1.2.1  膀胱癌细胞株T24的培养  膀胱泌尿上皮癌细胞T24株于含10%小牛血清的RPMI 1640培养液(内含青霉素、链霉素10万U/L)中37 ℃、5%CO2培养至细胞对数生长期,进行实验。

    1.2.2  MTT法观察  用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液,分别将2种对数生长期的膀胱癌细胞调配成5×104/mL的单细胞悬液,接种于96孔板(0.2 mL/孔)。设空白阴性对照组及不同浓度(50、100、200、400 μg/mL)的TP组,各设5个平行孔,培养48 h,实验终止前4 h加入MTT液(5 mg/mL)10 μL/孔,反应完毕弃上清液加入DMSO 100 μL/孔溶解沉淀,轻轻振动后用波长570 nm的酶联仪测定各孔的A值,求出生长抑制率IR=(1-用药组平均A值/对照组平均A值)×100%。上述所有实验均重复3次。

    1.2.3  流式细胞仪测定(FCM)  取对数生长期的膀胱癌细胞,取1×106/mL细胞接种到96孔培养板(0.2 mL/孔),每组3孔。加入不同浓度的TP,并各设2个平行组为TP组;加入等体积生理盐水的RPMI 1640细胞培养液为对照组。培养48 h后,以0.25%胰蛋白酶消化,制成细胞悬液,TP组和对照组分别进行下列检测。①细胞周期的检测:PBS洗涤2次,加入10 mg/L RnaseA 200 μL,水浴30 min,碘化丙啶染色30 min,4 ℃避光。FCM检测细胞周期,并计算细胞分裂增殖指数(PI)=(S+G2M)/(G1+S+G2M)×100%。②癌细胞PTEN表达强度的检测:平行组和对照组分别加入鼠抗人PTEN 20 μL,PBS洗涤5 min,共洗3次;分别加入1∶40稀释的羊抗鼠IgG-FITC抗体20 μL,37 ℃孵育30 min,PBS冲洗5 min,共洗3次;4 ℃孵育30 min后,FCM检测膀胱癌细胞PTEN的表达,以荧光强度的几何均数表示。③细胞凋亡率(APO)检测:平行组和对照组分别用Celleguest软件分析,根据细胞fl2荧光分布直方图(fl2为接收波564-606)获取阳性标记细胞的凋亡率。上述所有实验均重复3次。

  1.2.4  统计学处理  数据以均数±标准差(x±s)表示,运用SPSS10.0 软件进行分析,组间比较采用t检验。

    2  结    果

    2.1  TP抑制膀胱癌细胞生长及对细胞增殖周期的影响  TP处理48 h后,T24细胞随着TP浓度从0 μg/mL升到400 μg/mL,其生长抑制率从0增加至11.2%、33.4%、36.9%、67.5%,TP的浓度与其生长抑制率呈现明显的正相量效关系。FCM分析发现:G1期细胞所占细胞周期的百分比随着TP浓度的增加而增加,S期和G2M期细胞逐渐减少;同时随着TP浓度的增加,PI值逐渐减小,提示细胞分裂增殖活动逐渐减弱,细胞各周期中的变化也显示一定的量效关系(表1)。

    2.2  TP诱导T24细胞凋亡  碘化丙啶染色FCM检测可见在正常G1期峰前出现不同于细胞碎片图形的亚二倍体峰(凋亡峰),目前认为此峰的出现是确定细胞发生凋亡的标志之一。随着TP浓度的增加,T24细胞的凋亡率亦逐渐增加,由空白对照组的6.8%逐渐增加至TP作用浓度为400 μg/mL时的41.2%,提示TP诱导T24细胞凋亡率有一定的量效关系。

    2.3  TP上调PTEN蛋白的表达  随着TP作用浓度的升高,T24细胞PTEN蛋白的表达水平逐渐增强,并与TP抑制细胞的生长(IR值)及诱导癌细胞凋亡率相平行。在TP>50μg/mL的各个浓度点,各细胞株与其对照组的PTEN蛋白表达有显著性差异(P<0.05或P<0.01,表1)。表1  膀胱癌T24细胞经TP处理前后细胞各浓度点的分布和PTEN表达

    3  讨    论

    TP是非细胞毒类药物,通过对基因调控或抑制DNA复制相关酶活性及核苷转运影响DNA合成,干预细胞增殖有关的信号通路,诱导肿瘤细胞凋亡或直接抑制肿瘤细胞生长、杀死肿瘤细胞[1-5]。本研究结果提示,在剂量较大时,TP以剂量依赖方式抑制膀胱肿瘤T24细胞株的生长增殖,诱导其凋亡,并使T24细胞阻滞于G1/S限制点。但其诱发凋亡的机理目前尚未明了,可能与其调控某些癌基因/抑癌基因的表达有关,包括bcl-2、c-fos、c-myc、p53、survivin[6]。

    PTEN是一个具有双特异磷酸酶活性的抑癌基因,活化的PTEN能调控3、4、5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)活性,阻断蛋白激酶B(PKB/Akt),使细胞阻滞于G1期并使其对凋亡敏感,并具有抗肿瘤细胞浸润、转移的作用[7-9]。Liang等[3-4]通过对乳腺癌细胞的研究,认为茶多酚的重要成分表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和黄酮类化合物(flavopiridol)可通过调控肿瘤细胞G1期的p21、p27、细胞周期素(cycles)和细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)的活性,抑制乳腺癌细胞生长。Tanaka等[9]将野生型PTEN通过腺病毒载体导入UMUC23和T24膀胱癌细胞系,使PTEN过表达,抑制了PKB/Akt的磷酸化活性,出现细胞周期G1期的停滞,生长抑制,形态发生明显的变化,对化疗药物的敏感性增强。本研究结果提示,TP 400 μg/mL作用于T24细胞,其抑制率为67.5%、APO为41.1%,且以正相剂量依赖关系上调T24细胞的PTEN蛋白表达。抑制率和凋亡率的上升与细胞表达PTEN水平增高相一致。表明,细胞PTEN蛋白的表达变化是肿瘤细胞发生凋亡和生长抑制的可能原因。推测TP可能通过PTEN表达的上调,调控PKB/Akt信号通路,进而调节细胞周期蛋白(cyclin)E/D、CDKs、细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂(CKIs)等的活性,抑制T24细胞的生长增殖,并诱导细胞凋亡[7-10]。两方面的协同作用可能是TP杀灭膀胱癌细胞的作用机制之一。

    TP的这种细胞毒作用选择性不高,不仅对肿瘤细胞有明显的杀伤作用,对正常组织细胞也有杀伤作用。如何减少TP对正常组织细胞的损伤并进一步阐明TP影响PTEN表达量及其相互作用机制等问题,尚需进一步研究。

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