RNA干扰对肾癌细胞端粒酶活性及增殖、凋亡的影响

　　作者：郝 林 作者单位：221002 江苏徐州医学院附属医院泌尿外科

　　【摘要】 目的 探讨针对人端粒酶RNA(hTR)及其催化亚基(hTERT)的小干扰RNA(siRNA)对肾癌细胞端粒酶活性及其增殖、凋亡的影响。方法 将hTRsiRNA、hTERTsiRNA(100nmol/L)单独或联合转染人肾癌7860细胞，采用RTPCR法检测hTR、hTERT mRNA表达，TRAPELISA法检测端粒酶活性，MTT法检测细胞增殖，免疫组化TUNEL法检测细胞凋亡。结果 (1)hTRsiRNA可显著降低7860细胞hTR mRNA表达(P<0.01)，hTERTsiRNA可显著降低hTERT mRNA表达(P<0.01)，但彼此互不影响。(2)二者均能显著抑制端粒酶活性(P<0.01，P<0.01)，并增加7860细胞增殖抑制率及凋亡细胞阳性率 (P<0.01，P<0.01)。二者联合应用与单独应用差异亦无显著性(P>0.05)。结论 hTR、hTERT siRNA通过抑制各自基因表达，抑制人肾癌细胞端粒酶活性，进而抑制增殖、促进凋亡。

　　【关键词】 肾癌 干扰RNA 端粒酶RNA 端粒酶逆转录酶

　　端粒酶被激活导致肿瘤细胞无限增殖，抑制端粒酶活性能使肿瘤细胞无法合成端粒而凋亡，因此是肿瘤治疗的理想靶点[1]。端粒酶主要由端粒酶RNA(hTR)及端粒酶逆转录酶(hTERT)组成。端粒酶以hTR为模板合成端粒DNA，hTERT则是催化这一反应的唯一限速酶。RNA干扰能特异、高效阻抑靶基因表达，有望成为肿瘤基因治疗的有力工具。我们应用RNA干扰技术阻抑hTR、hTERT表达,观察其对肾癌细胞端粒酶活性及增殖、凋亡的影响。

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　人肾癌透明细胞株7860由本室保存。hTRsiRNA、hTERTsiRNA、阴性对照siRNA、siRNA转染试剂盒为美国Ambion公司产品。总RNA提取试剂盒、RTPCR试剂盒为美国Promega公司产品。TRAPELISA端粒酶活性检测试剂盒购自Roche公司。原位末端凋亡检测试剂盒购自Santa Cruz公司。

　　1.2方法

　　1.2.1siRNA的设计、合成

　　由Ambition公司设计、合成针对人端粒酶hTR序列及hTERT基因显性失活突变体区(NM003219，碱基序列位置2182～2200)的siRNA。hTR序列如下:正义链： 5'UUGUCUAACCCUAACUGAGtt 3'，反义链3'ttAACAGAUUGGGAUUGACUC5'。hTERT序列如下:正义链5'CAAGGUGGAUGUGACGGGCtt3'.反义链3'ttGUUCCACCUACACUGCCCG5'。经基因库检索确认与hTR、hTERT以外的基因序列无同源性。

　　1.2.2细胞培养及转染

　　7860细胞于含10%FCS的RPMI1640中常规培养48h，按转染试剂盒说明将hTRsiRNA、hTERTsiRNA调整到终浓度为100 nmol/L，单独或联合加入培养细胞内,另以生理盐水(空白对照)、脂质体、阴性对照siRNA作对照。培养24h后检测hTR/hTERT mRNA表达及端粒酶活性，72h后检测细胞增殖及凋亡。

　　1.2.3RTPCR

　　提取总RNA，RTPCR试剂盒一步法行RTPCR反应。hTR上、下游引物序列如下：5'CTGGGAGGGGTGGTGGCCATTT3'， 5'CGAACGGGCCAGCAGCTGACAT3'。hTERT引物：5'GCCAGAACGTTCCGCAGAGAAAA3'，5'AATCATCCACCAAACGCAGGAGC3'。以GADPH基因作为内参照。取PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳，紫外照相并扫描分析，以hTR、hTERT/GADPH表达水平行半定量分析。

　　1.2.4端粒酶活性的测定

　　采用端粒重复序列扩增酶联免疫吸附(TRAPELISA) 法进行检测,根据A=A450A690计算端粒酶活性,并计算与空白对照组比值。具体步骤按说明书进行。

　　1.2.5MTT法检测细胞增殖

　　处理后7860细胞加入MTT10μl/孔(5mg/ml)，继续培养4h后吸弃上清。加入二甲亚砜100μl/孔，溶解甲瓒紫结晶，酶标仪570nm波长处测定吸光度A值，计算抑制率。

　　1.2.6TUNEL法检测细胞凋亡

　　7860细胞于玻片上固定，洗片后与Triton100共同孵育2min，滴加TUNEL反应混合液，在湿盒中37℃孵化1h，PBS洗3次，二氨基联苯染色，洗片后封片。高倍镜下随机计数5个视野，细胞核呈黄褐色即为阳性，计算阳性细胞百分比。

　　2结果

　　2.1siRNA对7860细胞hTR、hTERT mRNA表达的影响

　　与阴性siRNA对照组比较，hTRsiRNA组hTR mRNA水平明显下调(P<0.01)，hTERT mRNA水平无明显变化(P>0.05)。hTERTsiRNA组hTERT mRNA水平明显下调(P<0.01)，hTR mRNA水平无明显变化(P>0.05),见表1。表1 hTRsiRNA、hTERTsiRNA对肾癌7860细胞注：与阴性siRNA组比较，#P>0.05，*P<0.012.2siRNA对7860细胞端粒酶活性的影响

　　hTRsiRNA和hTERTsiRNA均能明显抑制端粒酶活性(P<0.01)，但二者比较差异无显著性(P>0.05)。联用组与单用组比较差异无显著性(P>0.05),见表2。表2hTRsiRNA、hTERTsiRNA对肾癌7860细胞端粒酶活性及增殖、凋亡的影响注：与阴性siRNA组比较，*P<0.01;三组之间两两比较，#P>0.052.3siRNA对7860细胞增殖的影响

　　hTRsiRNA和hTERTsiRNA均能明显抑制7860细胞增殖，二者比较差异无显著性(P>0.05)。联用组与单用组比较差异无显著性(P>0.05),见表2。

　　2.4siRNA对7860细胞凋亡的影响

　　hTRsiRNA和hTERTsiRNA均能明显促进7860细胞凋亡，二者比较差异无显著性(P>0.05)。联用组与单用组比较差异无显著性(P>0.05),见表2。

　　3讨论

　　端粒位于线性染色体末端，细胞每分裂一次端粒序列缩短50～200bp,当缩短至临界长度时细胞凋亡[2]。端粒酶是催化合成并维持端粒长度的一种核糖核蛋白,由端粒酶RNA(hTR)、端粒酶催化亚基(hTERT)组成，它能以hTR为模板，在hTERT催化下合成端粒,以弥补缩短的端粒[3]。癌细胞由于端粒酶的激活使染色体端粒维持在一定长度，一方面使细胞获得永生，另一方面使细胞周期缩短、生长变快[3]。研究证实针对hTR、hTERT的反义核酸能够通过抑制端粒酶活性，抑制多种肿瘤细胞增殖并诱导凋亡[1,4]。Kanaya等[5]报道hTR、hTERT在肾癌组织的检出率分别为80%、86%,且其表达与端粒酶活性呈正相关，而正常肾组织无hTERT表达，因此hTR、hTERT是肾癌基因治疗的有效靶点。

　　RNA干扰是由小片断双链RNA(siRNA)介导的转录后基因沉默技术。siRNA进入细胞后与RNA诱导的沉默复合体(RISC)结合，并在RISC作用下特异性降解靶基因mRNA，其效率比单链反义RNA强100倍[6]，因此siRNA可在体内外抑制癌基因表达，并抑制肿瘤生长[7]。本研究发现siRNA可抑制肾癌细胞hTR、hTERT基因表达，且具有高度特异性。hTR、hTERT表达抑制后，肾癌细胞端粒酶活性降低。二者抑制端粒酶活性作用相仿，联用亦不能增强抑制作用。我们的研究结果与Kosciolek在结肠癌、宫颈癌细胞中获得的结果一致[8]。

　　本研究还发现hTRsiRNA与hTERTsiRNA具有相似的抑制肾癌细胞增殖、促进凋亡作用，联合应用也不能增加其作用。肿瘤细胞端粒酶活性下降后，通常需要数周时间，肿瘤细胞经过数代分裂使端粒缩短至临界值后才能凋亡[9]。但如果肿瘤细胞的端粒加帽延长功能具有缺陷，肿瘤细胞也能立即出现增殖抑制、凋亡增加[10]。本研究siRNA处理后72h细胞即出现增殖抑制、凋亡增加，可能与7860细胞端粒加帽延长功能缺陷有关。

　　【参考文献】

　　[1] 许宁，赵忠文，石爱平，等.端粒酶反义寡核苷酸对肾癌细胞端粒酶活性及其体外增殖的影响[J].中华泌尿外科杂志，2000,21(6):331333.

　　[2]Richard CA,Homagoun V,Christopher P.Telomeres length predicts replicative capacity of human fibroblasts[J].Proc Natl Acad Sci USA,1992,89(21):1011410118.

　　[3]Holt SE,Glinsky VV,Ivanova AB,et al.Resistance to apoptosis is in human cell conffered by telomerase function and telomere stability[J].Mol Carcinog,1999,25(4):241248.

　　[4]Zhang Y,He DM.Effect of antisense hTERT mRNA oligodeoxynucleotide on telomerase activity of leukemic cells [J].Cell Biol Int,2002,26(5):427431.

　　[5]Kanaya T,Kyo S,Takakura M,et al.hTERT is a critical determinant of telomerase activity in renalcell carcinoma [J].Int J Cancer,1998,78(5):539543.

　　[6]Lipardi C,Wei Q,Paterson BM.RNAi as random degradative PCR:siRNA primer convert mRNA into dsRNAs that are degraded to generate new siRNAs[J].Cell,2002,107(4):297307.

　　[7]Martinez LA,Naguibneva I,Lehrmann H,et al.Synthetic small inhibiting RNAs:Efficienct tools to inactivate oncogenic mutations and restore p53 pathways[J].PNAS,2002,99 (23):1484914854.

　　[8]Kosciolek BA,Kalantidis K,Tabler M,et al. Inhibition of telomerase activity in human cancer cells by RNA interference [J].Mol Cancer Ther,2003,2(3):217218.

　　[9]Hahn WC,Stewart SA,Brooks MW,et al.Inhibition of telomerase limits the growth of human cancer cells [J].Nat Med,1999,5(10):11641170.

　　[10]Kondo Y,Koga S,Komata T,et al.Treatment of prostate cancer in vitro and in vivo with 2 5Aantitelomerase RNA component [J].Oncogene,2000,19(18):22052211.