凋亡相关基因Survivin及Caspase3 mRNA在膀胱移行细胞癌中的表达及其意义

作者：管维，周四维，王勤章，叶章群    作者单位：华中科技大学同济医学院附属同济医院泌尿外科，湖北武汉 430030 　　【摘要】  目的 探讨凋亡相关基因survivin及Caspase3 mRNA的表达与膀胱移行细胞癌发生及发展的关系。方法 应用逆转录聚合酶链式反应(RTPCR)检测33例膀胱移行细胞癌组织中survivin和Caspase3 mRNA表达的情况，结合临床资料进行分析。结果 93.9%(31/33)的肿瘤组织可检测到survivin mRNA表达， 而对照组全部阴性表达，二者有统计学意义；81.8%(27/33)的肿瘤标本可检出Caspase3 mRNA，而对照组中检出率为80%(8/10)，实验组与对照组间无明显差异。在III级膀胱移行细胞癌中survivin mRNA的表达强度较I级为高，二者间有统计学意义(P<0.05)。survivin和Caspase3的表达与肿瘤的临床分期无关(P>0.05)。结论 survivin mRNA在膀胱移行细胞癌中有特异性表达，其高表达提示肿瘤分化不良。阻断suvivin mRNA的表达可能为膀胱肿瘤的治疗提供新的途径。

　　【关键词】  膀胱癌

　　近年来，通过肿瘤的基础研究认为凋亡的下调是肿瘤发生学中的中心事件。survivin是凋亡抑制基因家族的成员之一，在多数人类常见恶性肿瘤中可观察到survivin的过表达，可能与肿瘤细胞逃避凋亡以及有丝分裂的异常有关[14]。前期研究已经探讨了survivin蛋白在膀胱移行细胞癌中表达的情况，但是survivin表达的上调到底是在蛋白水平还是在RNA水平尚不清楚。Caspase3作为survivin的直接抑制对象，其mRNA水平在膀胱肿瘤中有无变化亦需进一步研究。本实验采用了RTPCR方法对33例膀胱移行细胞癌患者的组织标本进行检测，以评价survivin以及Caspase3 mRNA的表达在膀胱移行细胞癌生物学行为中的地位和作用。

　　1  材料与方法

　　1.1  临床资料  收集我院1999年1月至2003年3月33例膀胱癌患者手术的新鲜组织标本，手术后病理证实均为膀胱移行细胞癌。其中男27例，女6例，年龄35-72岁(平均57.3岁)。另选择10例癌旁正常膀胱黏膜作为阴性对照。膀胱癌按WHO病理分级标准：Ⅰ级11例，Ⅱ级16例，Ⅲ级6例；按UICC TNM标准分期：Ta-T1期13例，T2-T4期18例。所有标本均冻存于-70℃备用。

　　1.2  实验方法  采用RTPCR法。RNA提取试剂盒和DEPC为Gibco BRL公司产品。逆转录试剂盒为Takara公司产品。无RNA酶水自制，另备氯仿、异丙醇、75%(体积分数)乙醇等。其他试剂均为国产分析醇或进口分装。分子量标记分别为DL 2000(TaKaRa公司)和PCR ladder。Survivin 引物：5′GGACCACCGCATCTCTACAT(上游)；5′GCACTT TCTTCGCAGTTTCC(下游)，预扩增片断为338bp。Caspase 3引物：5′CGTGTATTGTGTCCATGCTCAC(上游)；5′CCATCATTGACAGTTACTTGCTCC(下游)，预扩增片断为271bp；内参GAPDH引物：5′GGGGAGCCAAAAGGGTCATCATCT(上游)；5′GAGGGGCCATCCACAGTCTTCT(下游)，预扩增片断为235bp。Survivin及Caspase3引物经primer软件比对，符合要求。所有引物均由上海生物工程公司合成(5 OD值)。实验步骤按说明书进行。10g/L琼脂糖凝胶电泳，拍照。用 SQ9636型扫描系统扫描， HPIAS1000图像分析系统检测各组目的基因及GAPDH基因(内参)的积分吸光度值，以二者的比值代表各组mRNA的表达量。

　　1.3  统计分析  使用SPSS 10.0软件包统计分析，实验组与对照组的比较采用χ2检验，各实验组相对平均表达水平间的比较采用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  Survivin mRNA 在膀胱移行细胞癌中的表达  本组共33例膀胱移行细胞癌标本中，有31例survivin mRNA表达阳性，阳性率为93.9%(31/33)，而对照组全部表达阴性，两者间有统计学意义(P<0.05，图1)。以GAPDH作内参进行半定量分析后发现，survivin mRNA的表达强度在Ⅰ级和Ⅲ级膀胱移行细胞癌之间的差异有统计学意义(P<0.05)，但是与膀胱肿瘤的分期无明显相关性(表1)。

　　图1  survivin mRNA在膀胱移行细胞癌中的表达（略）

　　表1  Survivin及Caspase3 mRNA在膀胱移行细胞癌中的表达（略）

　　*P<0.05 vs. Ⅰ级

　　2.2  Caspase3 mRNA在膀胱移行细胞癌中的表达  本组33例膀胱移行细胞癌标本中，有31例Caspase3 mRNA表达阳性，阳性率为81.8%(27/33)，而对照组阳性表达率为80%(8/10)，实验组与对照组间无明显差异(图2)。以GAPDH作内参进行半定量分析后发现，Caspase3 mRNA的表达强度与膀胱移行细胞癌的病理分级、临床分期均无明显相关性(表1)。

　　图2  Caspase3 mRNA在膀胱移行细胞癌中的表达（略）

　　3  讨论

　　多年来，人们对膀胱移行细胞癌进行了各方面的研究，试图阐明其发病机制及生物学行为的分子基础。随着认识的深化，人们发现了与许多膀胱肿瘤相关基因，如Hras基因、cmyc基因、CerbB族基因、cjun基因以及MDM2基因，抑癌基因家族中的Rb基因、p53基因、p16及p15基因，还有fas/fasL基因、bcl2基因、survivin基因等凋亡相关基因[311]。近年来，对凋亡路径的研究取得了很大的进展，人们认识到凋亡主要通过死亡受体途径和线粒体途径发挥作用，Caspase3作为其核心环节，一旦在各种刺激下被活化，即可启动凋亡。因此，正常凋亡机制的失调往往与Caspase3的活性受到抑制有关，从而使细胞特别是突变细胞的正常灭活失败，出现细胞的无限增殖或恶变，进而导致肿瘤的发生。Survivin正是这样一种强烈的抗凋亡基因，其产物可直接抑制Caspase3的活性，阻断凋亡的进行。1995年Altier利用效应细胞蛋白酶受体Ⅰ(effector cell protcase receptor1, EPR－1)cDNA在人类基因组库中筛选克隆出survivin基因，位于17q25[12]。由14796个核苷酸组成的survivin基因序列含有4个外显子和3个内含子[13]。由分子大小为1.9kb的mRNA编码产生的survivin蛋白是一种由142个氨基酸组成的分子量约为16.2kD的胞浆蛋白，不含有氨基末端信号肽或者是插入胞膜所需的羧基末端疏水段。与其它IAP不同，survivin只含有一个与XIAP的第二个BIR结构域(BIR2)氨基酸序列类似的结构域，没有其它IAP固有的羧基末端环指(与锌结合的结构域)[1415]，而代之以羧基末端卷曲结构[16]。研究证实，XIAP的BIR2对抑制Caspase是必需的，足以单独发挥作用，参与包括凋亡在内的多种细胞生理过程[1516]。Survivin保留了IAP家族最关键的BIR结构，其羧基末端卷曲结构是survivin与纺锤体微管结合的位点，若此处突变，则丧失与微管结合能力而不能发挥抗凋亡作用[1]。Survivin的组织分布具有明显的细胞选择性，本研究发现，survivin表达于胚胎和发育的胎儿组织，但未见于终末分化的成人组织(胸腺、生殖腺除外)，这有利于胚胎与胎儿组织内环境的稳定和分化。用survivin特异性探针和抗体在多种胚胎组织中均可检测到survivin的转录、翻译产物，而在各种成人组织(胸腺、生殖腺除外)，包括外周血淋巴细胞，淋巴结均未检出[17]。这一方面表明survivin的表达在人类发育过程中起着某些重要的作用，同时也说明成人正常组织中survivin的表达处于静息状态。而在多数肿瘤组织内都存在survivin的普遍表达，说明其在肿瘤的发病机制中具有重要作用。本研究显示，survivin mRNA在正常膀胱黏膜中无表达，而在膀胱移行细胞癌中表达率达90%以上，同时显示survivin的表达与膀胱肿瘤的发生密切相关。而作为受到survivin抑制的Caspase3，其mRNA水平在膀胱肿瘤及正常组织中无明显差异，说明Caspase3并没有在转录水平受到survivin的影响。因此，了解survivin的表达如何得到调控对于研究肿瘤的发生机制具有重要的作用。有学者检测细胞内源性survivin RNA的表达，发现G1期不能检测到survivin RNA的表达，在S期细胞survivin RNA表达增加6.2倍，在G2/M期细胞survivin RNA的表达上调40倍[16]。Survivin在G2/M的强表达，提示其可能是细胞周期G2/M期的调节基因。而在G2/M期之后的G1期，mRNA和蛋白水平迅速下降，提示其表达在转录水平被调节。进一步研究发现，Survivin基因含有多转录起始点(Multiple Transcription Start Sites)，该起始位点是由无TATA的启动子和GC富集区，3个CDE区(GGCGG)和一个CHR区(ATTTGAA)组成。CDE区和CHR区为G1期抑制元件，可调节G2/M期基因的表达[12]。既然survivin可抑制细胞的凋亡，而使突变细胞正常灭活减少，从而导致肿瘤发生，那么研究如何抑制survivin的表达对于肿瘤的治疗将非常重要。人们发现效应细胞蛋白酶受体1(EPR－1)是天然的survivin反义基因，二者的基因序列广泛互补。因此，诱导EPR－1的表达可导致内源性survivin表达下调，使细胞的凋亡增加[14]。Grossman及Mesri等利用针对survivin的反义核酸转染至细胞内，也发现内源性survivin表达下降，促使细胞凋亡[1819]。因此，survivin的反义寡核苷酸有可能在肿瘤的基因治疗中发挥重要的作用。近期有研究还发现，表达磷酸化缺陷的survivin突变体可触发多种人类黑色素瘤细胞株的凋亡，并可增强由化疗药物顺铂介导的细胞死亡。动物实验也显示，survivin突变体可抑制黑色素瘤的生长，抑制率达60%-70%[20]。有学者还设计了针对survivin的特异性剪切酶以切断survivin mRNA，进而阻止survivin蛋白的表达。经检测发现肿瘤细胞的凋亡增加，而且提高了对化疗药物的敏感性[21]。由于survivin在肿瘤组织中的特异性高表达，使针对肿瘤的靶向治疗成为可能。用特异性识别survivin的抗体，结合其它抗肿瘤成分，可达到只杀伤肿瘤细胞而不影响正常细胞的目的。另外，利用近年来发展起来的RNA干扰技术来阻滞survivin的表达，可能起到促进肿瘤细胞的凋亡，改善肿瘤患者预后的作用[22]。

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