绿激光前列腺汽化(PVP)治疗前列腺癌导致的下尿路梗阻降低前列腺癌播散危险性的临床研究

作者：朱刚    作者单位：卫生部北京医院泌尿外科，北京 100730 　　【摘要】  目的 验证绿激光前列腺汽化(PVP)可以降低治疗前列腺癌导致的下尿路梗阻过程中前列腺癌细胞播散入血液循环的危险性。方法 4例前列腺癌患者和22例良性前列腺增生患者，因患有下尿路梗阻接受PVP治疗，分别于术前和术后取静脉血，用反转录PCR技术探测患者血液中的前列腺特异抗原(PSA)mRNA，以间接探测术后血液中是否有来自前列腺的上皮细胞。结果 PVP治疗前列腺癌导致的下尿路梗阻过程中由于前列腺血管得到较好封闭，没有前列腺上皮细胞进入血液循环。结论 应用PVP治疗前列腺癌不会导致前列腺癌细胞进入血液循环。

　　【关键词】  激光治疗

　　前列腺癌是西方国家最常见的男性肿瘤之一[1]。在我国目前已经上升至男性泌尿生殖系统肿瘤发病率的第三位[2]。前列腺癌或良性前列腺增生(Benign Prostatic Hyperplasia, BPH)导致的下尿路梗阻通常是应用经尿道前列腺电切术(Transurethral Resection of the Prostate, TURP)来完成的。但TURP可能会导致前列腺上皮细胞进入血液循环中，从而潜在地增加了术后发生转移的危险性[34]。绿激光前列腺汽化(Photoselective Vaporization of the Prostate, PVP)技术是一种新的高能量KTP激光，新近被用来治疗良性前列腺增生导致的下尿路梗阻。为了解是否在绿激光前列腺汽化过程中可以降低前列腺上皮细胞进入血液循环的危险性，本研究应用了反转录多聚酶链反应(RTPCR)来探测良性前列腺增生和前列腺癌患者接受绿激光前列腺汽化前后的血液标本中前列腺特异抗原(Prostate Specific Antigen, PSA)的mRNA，从而了解是否有前列腺上皮细胞进入血液循环。

　　1  材料与方法

　　1.1  组织培养  LNCaP系人类前列腺癌的细胞系。LNCaP细胞培养用前期描述的技术进行[5]。LNCaP细胞及自LNCaP细胞中提取的RNA在本研究中被作为阳性对照。

　　1.2  患者、绿激光前列腺汽化和血液标本  本研究为与英国伦敦大学国王学院医院泌尿外科协作课题，得到了英国伦敦大学国王学院医院道德委员会的批准并被准许在中国发表相关资料。患者为在英国伦敦大学国王学院医院泌尿外科2003年2月至8月接受治疗的临床确诊前列腺癌患者4名和BPH患者22名。同时有一位年轻的健康志愿者。患者年龄平均为44-83(65.2±8.1)岁。年轻志愿者为37岁。在术前和手术结束后5min抽取5mL患者静脉血，测定PSA值。所有的PVP都是通过F22.5持续冲洗膀胱镜进行，并用医用蒸馏水冲洗。

　　1.3  RNA提取  存放在细胞准备管(Vacutainers, Becton Dickinson, 牛津, 英国)中的血液标本在室温3100r/min的条件下离心20min。单核细胞用冰的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗过。将3个LNCaP细胞直接加入到健康志愿者的血液标本中(最终浓度为1 × 106个单核细胞中1个LNCaP细胞)作为阳性对照。按说明在这些单核细胞中加入800μL的TRIzoL 试剂(Invitrogen，英国)。提取的总RNA溶解于19μL无RNA酶的水中并加入1μL的RNA酶抑制剂(Invitrogen，英国)。

　　1.4  RTPCR  ①去除DNA污染程序：为了去除DNA污染，总RNA用DNA酶(DNase Ⅰ, 1 unit/μL，Invitrogen, 英国)处理。在这一过程中，10μg总RNA，2μL DNA酶反应缓冲液 (×10), 2μL DNase Ⅰ，然后加无RNA酶水至总量20μL。标本在室温下保存15min，然后加入EDTA(乙二胺四乙酸25mmol/L)1μL并在65℃加热10min。②反转录程序：反转录PCR扩增包括5μg DNA酶处理过的总RNA，反转录PCR缓冲液(Invitrogen，英国)，1μLSuperscript Ⅱ 反转录酶(200units/μL)，2μL二硫苏糖醇(0.1mol/L, Invitrogen，英国)和1μL Oligo (dT)1218引物(500ng/μL Invitrogen，英国)在20μL反应体积中。标本在42℃孵育50min然后加热至75℃ 15min终止转录酶的作用。③引物序列：PSA引物的序列如下：第一个PSA顺向引物在外显子3(5′GATGACTCCAGCCACGACCT3′)，逆向引物在外显子5(5′ CACAGACACCCCATCCTATC3′) [6]。

　　第二个PSA顺向引物在外显子2(5′TTGTGGCCTCTCGTGGCAGGGCAGT3′)，逆向引物在外显子4(5′TGGTCACCTTCTGAGGGTGAACTTGC3′) [12]。这种设计保证了PSA反转录PCR的产品是来自PSA的mRNA。GAPDH的引物序列为：顺向引物CGACCACTTTGTCAAGCTCA，逆向引物 AGGGGAGATTCAGTGTGGTG。④PCR反应条件： PCR反应用了5μL的cDNA。反应总量为25μL，包括2.5μL PCR缓冲液(Invitrogen, 英国)，0.75μL MgCl2(50mmol/L, Invitrogen, 英国)，0.5μL dNTPs (10mmol/L, Invitrogen, 英国)，分别加入0.5μL PSA顺向和逆向引物 (10mmol/L)，0.25μL Taq DNA 聚合酶(5 units/μL，Invitrogen，英国)和17.5μL的水。PCR扩增为变性94℃ 5min，然后每一循环, 变性94℃ 45s，退火60℃ 45s，延伸 72℃ 2min。经过35个循环后，PCR扩增有一个最终的延伸72℃ 7min。PCR扩增产物在10g/L的琼脂糖中电泳后，经0.01%(体积分数) 溴乙啶染色(1mg/mL, Sigma)后，在紫外线照射后显色。该PSA的RTPCR扩增产物为一个460碱基对长的PCR产物。在所有PCR扩增中用G3PDH产物作为扩增阳性对照。

　　本反转录PCR扩增设计曾被用来对前列腺癌和BPH患者接受TURP治疗进行过一个相似的研究，研究结果显示它可以敏感地探测到106个单核细胞中的1个PSA表达细胞[4]。

　　2  结果

　　PVP技术可以有效、持续和快速地去除前列腺组织。汽化几乎是在无血的视野下进行的。本组没有病例需要输血。PVP技术为患者解除了由于前列腺增大或前列腺癌肿块导致的下尿路梗阻。手术时间33-60min不等，平均(48.1±9.5)min。平均术前BPH患者PSA为(4.0±2.6)ng/mL[(0.310.9)ng/mL]，前列腺癌患者的术前PSA为1.2、1.7、7.1、50.9ng/mL。RTPCR结果显示，健康志愿者血液中没有探测到表达PSA细胞。阳性对照LNCaP细胞的PSA RTPCR扩增反应得到了明确的PSA mRNA扩增产物，一个460碱基对长的PCR产物。LNCaP细胞产生的阳性结果表明这个试验设计可以探测到在血液循环中106个单核细胞中的1个表达PSA细胞。也验证了本PCR扩增设计的敏感度。22例BPH患者术前术后标本PSA RTPCR扩增反应阴性，没有在血液循环中探测到表达PSA细胞。4例前列腺癌患者术前术后标本PSA RTPCR扩增反应阴性，同样没有在血液循环中探测到表达PSA细胞。表明在PVP手术过程中没有表达PSA细胞通过开放的静脉窦进入血液循环(图1)。应用PVP治疗由前列腺癌导致的下尿路梗阻降低了前列腺癌患者的扩散和转移的危险性。

　　图1  PSA反转录PCR扩增结果（略）

　　M：100碱基对的标记物；1：来自健康志愿者的阴性对照; 2：106个单核细胞中的1个LNCaP细胞；3：PVP手术之前(病例23；BPH)；4：PVP手术之后(病例23；BPH)；5：PVP手术之前(病例25；前列腺癌)；6：PVP手术之后(病例25；前列腺癌)；7：阳性对照LNCaP细胞

　　3  讨论

　　Liotta[7]在动物实验中表明，循环血液中4个肿瘤细胞似乎就足够导致肿瘤的血行播散。1992年Hamdy[8]报道在晚期前列腺癌患者循环血液中发现有PSA表达阳性的细胞。一般来讲PSA只由前列腺的上皮细胞产生，表明产生PSA的细胞几乎均来自前列腺[910]。没有直接的证据表明探测到的PSA阳性细胞就是肿瘤细胞，但依然存在治疗前列腺癌时肿瘤细胞进入血液循环的危险性。虽然我们目前无法确认这些PSA阳性细胞是正常前列腺上皮细胞还是恶性肿瘤细胞，但很显然，PSA阳性细胞出现在血液循环中是一种不正常的状态。因而我们可以推测血液循环中出现PSA阳性细胞和出现转移可能存在一定联系。有研究表明PSA RTPCR结果阳性率和不同前列腺癌临床分期一致，分期越高，PSA RTPCR结果阳性率就越高[3]。在治疗前列腺癌的过程中，特别是TURP过程中，我们要尽可能减少前列腺上皮细胞的播散。如同前列腺癌根治术标本的外科切缘和Gleason评分一样，前列腺癌根治术后的PSA RTPCR扩增结果和前列腺癌的进展相关。Shariat[11]报道4例PSA RTPCR扩增结果在术前阴性但术后为阳性的患者发生了前列腺癌的转移。国王学院医院的前期研究表明，TURP可以使BPH患者的血液中出现8.8%的PSARTPCR扩增阳性率，在前列腺癌患者中出现16.7%的阳性率。接受TURP治疗的另外5例患者术前和术后均有PSA RTPCR扩增阳性。但术后的PCR扩增产物带较术前强度高[4]。这些结果提示手术导致的前列腺癌细胞进入血液循环可能在前列腺癌转移中有重要作用。本研究中所使用的方法已被前期的研究证实为可以探查到106单核细胞中的1个LNCaP细胞。通过Cla I 限制性酶切也证实了反转录PCR扩增产物来自PSA mRNA。这些验证结果确保了没有因为错误扩增同样大小的PCR扩增产物[4]。另一个机构应用相似的方法将探测的敏感度提高到了探查到108单核细胞中的1个LNCaP细胞[12]。在我们的研究中没有在BPH和前列腺癌患者PVP术前和术后的标本中发现PSA RTPCR扩增阳性结果。本组入组病例数相对较少，但研究结果也许反映了一个事实，那就是应用PVP治疗前列腺癌导致的下尿路梗阻可能不会导致前列腺癌细胞进入血液循环。PVP过程是一个无血的过程。在治疗过程中前列腺血管被很快凝固封闭，从而减少了上皮细胞通过开放的静脉血管进入血液循环。与国王学院医院前期的研究相比[4]，PVP已经被证实在减少前列腺上皮细胞播散入血液循环方面是一个更安全的方法。因而PVP是一项治疗由前列腺癌引起下尿路梗阻安全和有效的技术。我们的灌注吸收研究结果没有发现PVP过程中有冲洗液吸收的事实[13]，我们认为，相对于TURP，PVP可以降低前列腺上皮细胞播散到血液循环中的危险性。但本研究样本量比较小，得出的结论还需要前瞻性、随机对照、大样本量和多中心的研究进一步证实。 

【参考文献】　　[1]Landis SH, Murray T, Bolden S, et al. Cancer statistics [J]. CA Cancer J Clin, 1999, 49(1):831.

　　[2]孙颖浩.我国前列腺癌的研究现状 [J].中华泌尿外科杂志, 2004,25(2):7781.

　　[3]Corey E, Corey MJ. Detection of disseminated prostate cells by reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RTPCR): technical and clinical aspects [J]. Int J Cancer, 1998, 31(77):655673.

　　[4]Heung YM, Walsh K, Sriprasad S, et al. The detection of prostate cells by the reverse transcriptionpolymerase chain reaction in the circulation of patients undergoing transurethral resection of the prostate [J]. BJU Int, 2000, 85(1):6569.

　　[5]Israeli RS, Miller WH Jr, Su SL, et al. Sensitive nested reverse transcription polymerase chain reaction detection of circulating prostatic tumor cells: comparison of prostatespecific membrane antigen and prostatespecific antigenbased assays [J]. Cancer Res, 1994, 54(24):63066310.

　　[6]Hara N, Kasahara T, Kawasaki T, et al. Reverse transcriptionpolymerase chain reaction detection of prostatespecific antigen, prostatespecific membrane antigen, and prostate stem cell antigen in one milliliter of peripheral blood: value for the staging of prostate cancer [J]. Clin Cancer Res, 2002, 8(6):17941799.

　　[7]Liotta LA, Kleinerman J, Saidel GM. Quantitative relationships of intravascular tumor cells, tumor vessels, and pulmonary metastases following tumor implantation [J]. Cancer Res, 1974, 34(5):9971004.

　　[8]Hamdy FC, Lawry J, Anderson JB, et al. Circulating prostate specific antigenpositive cells correlate with metastatic prostate cancer [J]. Br J Urol, 1992, 69(4):392396.

　　[9]Zarghami N, Diamandis EP. Detection of prostatespecific antigen mRNA and protein in breast tumors [J]. Clin Chem, 1996, 42(3):361366.

　　[10]Levesque M, Yu H, D'Costa M, et al. Immunoreactive prostatespecific antigen in lung tumors [J]. J Clin Lab Anal, 1995, 9(6):375379.

　　[11]Shariat SF, Kattan MW, Song W, et al. Early postoperative peripheral blood reverse transcription PCR assay for prostatespecific antigen is associated with prostate cancer progression in patients undergoing radical prostatectomy [J]. Cancer Res, 2003; 63(18):58745878.

　　[12]Corey E, Arfman EW, Liu AY, et al. Improved reverse transcriptasepolymerase chain reaction protocol with exogenous internal competitive control for prostatespecific antigen mRNA in blood and bone marrow [J]. Clin Chem, 1997, 43(3):443452.

　　[13]Barber NJ, Zhu G, Donohue JF, et al. Use of expired breath ethanol measurements in evaluation of irrigant absorption during highpower potassium titanyl phosphate laser vaporization of prostate [J]. Urology, 2006, 67(1):8083.