梗阻性不稳定膀胱逼尿肌细胞内Ca2+及N型Ca2+通道的变化及意义

作者：程文 高建平 张征宇 葛京平    作者单位：南京军区南京总医院泌尿外科，南京 210002

【摘要】  目的 对Ca2+和N型Ca2+通道在兔不全梗阻性不稳定膀胱逼尿肌细胞中的变化进行研究。方法 成年同龄雄性新西兰白兔30只，随机分两组，15只中膀胱出口不全梗阻8 w尿流动力学证实为不稳定膀胱者为实验组，15只为对照组（成年雄性新西兰白兔仅仅手术游离兔膀胱颈而不做结扎梗阻为对照组）。采用急性酶法分离及传代培养的方法获得单个膀胱逼尿肌细胞，采用激光共聚焦显微镜观察模型膀胱逼尿肌细胞静态Ca2+浓度；运用共聚焦显微镜及免疫组织化学方法观察N型Ca2+通道在梗阻性不稳定膀胱逼尿肌细胞中的变化。结果 静息状态下不全梗阻性不稳定膀胱组逼尿肌细胞内游离钙离子浓度明显增高（Ca2+超负荷）；共聚焦显微镜及免疫组化均证实不稳定膀胱逼尿肌细胞膜之N钙离子通道数量明显增多。结论 膀胱逼尿肌细胞Ca2+及其N型Ca2+通道病理性改变是出现不稳定膀胱的重要因素。

【关键词】  Ca2+　N型Ca2+通道　兔不全性膀胱出口梗阻　不稳定膀胱

　　Changes in Ca2+ and Ntype Ca2+ channel in detrusor muscle cell of obstructively unstable bladder and their significances

　　CHENG Wen, GAO JianPing, ZHANG ZhengYu, et al.

　　Department of Urology Surgery, Nanjing General Hospital of Nanjing Military District, Nanjing 210002, Jiangsu, China

　　【Abstract】  Objective  To study the changes in Ca2+ and Ntype Ca2+ channel in detrusor muscle cells of the unstable bladder of rabbit's partial bladder outlet obstruction. Methods  30 male New Zealand White rabbits were randomly divided into 2 groups: the experiment group (15 rabbits with partial bladder outlet obstruction lasting for 8 weeks, those with unstable bladder were confirmed by urodynamics) and the control group (15 agematched New Zealand White rabbits only accepted bladder neck liberation without ligation obstruction as the control group). After established model, bladder detrusor muscle cells of the rabbits were isolated by acute collagenase digestion and serial subcultivation. The static Ca2+ concentration in bladder detrusor muscle cells were observed by confocal laser scanning microscope (CLSM). Ntype Ca2+ channel changes in detrusor muscle cells between the two group was observed by CLSM and immunohistochemistry.Results  Ca2+ concentration significantly increased in the experimental group (Ca2+ overload). The increased Ntype Ca2+ channels in membrane of bladder detrusor muscle cells were confirmed with CLSM and immunohistochemistry.Conclusions  It was an important pathogeny for the unstable bladder of partial bladder outlet obstruction that changes of pathology and pathophysiology of Ca2+ and its Ntype channels in the unstable bladder.    　　【Key words】  Ca2+; Ntype Ca2+ channel; Bladder outlet obstruction; Unstable bladder

　　膀胱逼尿肌在膀胱的贮存和排放尿液的过程中起着十分重要的作用，不稳定膀胱严重影响着许多人的生活质量。但膀胱出口梗阻导致不稳定膀胱的发病机理目前仍不十分清楚〔1〕。已发现人逼尿肌细胞收缩时Ca2+ 依赖的K+电流发生变化。豚鼠Ca2+依赖的K+通道抑制剂能延长其动作电位及梗阻肥厚膀胱逼尿肌细胞的收缩，同时膜片钳也证实逼尿肌存在大量Ca2+ 依赖的K+通道。最近，相继报道膀胱逼尿肌肌细胞兴奋性异常易导致不稳定膀胱的发生，而Ca2+及其通道在膀胱逼尿肌肌细胞的兴奋中起着重要作用。本文就Ca2+及其N型Ca2+通道在兔不全梗阻性不稳定膀胱逼尿肌细胞中的变化进行研究。

　　1  材料与方法

　　1.1  动物  成年同龄雄性新西兰白兔30只，体重约3 kg(购于南京军区南京总医院动物实验中心)，均采用自由觅食。

　　1.2  方法

　　1.2.1  试剂与仪器  DMEM、Ⅱ型胶原酶购于北京华美公司；胎牛血清购于杭州四季青公司；胰蛋白酶购于南京生兴公司。荧光染料Fluo3/AM为美国Molecular Probe Inc.产品。M受体激动剂（Carbachol）、N型钙离子通道阻滞剂（ωConotoxin GVIA）、sc15955：Ntype钙离子通道抗体 CP alpha 1B (P15)均购于Santa Cruz Biotechnology，IncC.。激光扫描共聚焦显微镜为德国蔡司（Carl Zeiss，LSM510，V2.3）。

　　1.2.2  模型制备  取15只成年同龄雄性新西兰白兔为实验组，其不稳性模型制作方法：静注硫喷妥钠麻醉（35 mg/kg，浓度2%，静注速度缓慢），下腹正中切口，进入腹腔，游离膀胱颈，于尿道内置入8F导尿管作支撑后，用4号丝线于膀胱颈处作结扎(结扎处位于双侧输尿管口下方)，其松紧度以结扎线圈能自由滑动为宜。另15只为对照组，静注硫喷妥钠麻醉（35 mg/kg，浓度2%，静注速度缓慢），下腹正中切口，进入腹腔，游离膀胱颈，但不进行尿道内置入8 F导尿管作支撑及丝线于膀胱颈处作结扎。术后肌注青霉素20万U 1次/d，连续用药5 d以防感染（参照Kato膀胱出口不全梗阻模型方法）。模型成功后，每周采用Laboria UDS600型尿流动力学检测仪。检测时肌注氯胺酮（200 mg/只）和安定（2.5 mg/只）。兔俯卧位固定，会阴部悬空，下方置尿流率收集器，测定尿流率；自尿道外口置入4 Fr双腔测压管，排空膀胱，灌注速度为1 ml/min,作充盈性膀胱测压及排尿性膀胱测压(参照适合于兔尿流动力学方法操作〔2〕)。另15只新西兰白兔为对照组。    　　采用急性酶法分离及传代培养的方法获得单个膀胱逼尿肌细胞。对培养的第一代细胞进行计数后，按照1×105～1×106密度将细胞接种于96孔板中，待模型膀胱逼尿肌细胞贴壁后。

　　1.2.3  检测指标  ①静息状态下对实验组、对照组的单个膀胱逼尿肌细胞中Ca2+进行共聚焦检测；②对照组：加M受体激动剂、加N型Ca2+通道阻滞剂和M受体激动剂，实验组：加M受体激动剂、加N型Ca2+通道阻滞剂和M受体激动剂。PBS（无钙）缓冲液洗2次；加含钙PBS缓冲液及Fluo3AM负载（终浓度为10 μmol/L）；37℃孵育30 min；用PBS（无钙）缓冲液洗1次；上机检测。

　　1.3  统计学处理  采用t检验，应用SPSS 10.0统计软件分析。实验数据以x±s表示。

　　2  结果

　　2.1  不稳定膀胱的检测   实验组中9只出现不稳定膀胱，发生率为60%。

　　2.2  梗阻后最大尿流率(Qmax)、最大尿流率时逼尿肌压力(PetMax)、最大膀胱容量(CC)、膀胱最大顺应性（膀胱最大顺应性=最大膀胱容量/充盈静止压空虚静止压Compl）及尿道阻力因子(URA)梗阻组与对照组间差异具有显著意义(表1)。

　　2.3  实验兔所有标本均获成功  倒置显微镜观察培养平滑肌细胞24 h均可见膀胱逼尿肌细胞贴壁生长，正常兔7 d左右、而梗阻兔则需10～12 d可于50 ml培养瓶约80%汇合。倒置显微镜下观察均呈“谷和峰”样结构。免疫组化染色检测αactin呈阳性反应。电镜检查可见平滑肌细胞密班结构，细胞爬片HE染色见膀胱逼尿肌细胞细胞核呈两端钝圆的卵圆形平滑肌细胞核型。从细胞爬片HE染色和免疫组化染色检测αactin呈阳性反应中发现该方法所得膀胱逼尿肌细胞纯度几乎99%〔3〕。

　　表1  实验组及对照组尿流动力学变化（略）

　　与对照组比较：1）P＜0.05，2）P＜0.01

　　2.4  逼尿肌细胞内游离钙离子浓度测定结果  静息状态下实验组平滑肌细胞内游离钙离子浓度增高(实验组：108.36±23.13；对照组：78.11±10.12，P＜0.01）（图1）。

　　图1  逼尿肌细胞内游离钙离子浓度（略）

　　2.5  共聚焦显微镜及免疫组化均证实膀胱逼尿肌细胞膜均存在N钙离子通道，且不稳定膀胱逼尿肌细胞膜之N钙离子通道数量明显增多，实验组与对照组细胞内荧光强度：实验组：121.24±8.29（M激动），51.17±9.26 （N阻滞+ M激动）；对照组：113.24±10.11（M激动），75.65±9.74（N阻滞+ M激动）（P＜0.01）。实验组和对照组N型钙离子通道免疫组化图像分析：实验组6.69±1.57；对照组 2.68±0.83（P＜0.01），实验组明显高于对照组(图2，对照组A1、B1，实验组A2、B2)；免疫组化见图3，实验组较对照组明显增多。

　　A1，B1(对照组)；A2，B2（实验组）

　　图2  逼尿肌细胞内荧光强度变化（略）

　　图3  逼尿肌细胞N型钙离子通道免疫组化（略）

　　3  讨论    　　本实验所有膀胱逼尿肌细胞标本均获成功。该方法已通过多种方法鉴定所获细胞为膀胱逼尿肌〔3，4〕。平滑肌收缩蛋白质之间的相互作用，是有别于骨骼肌的另一种机制而诱发的，一般认为，当平滑肌细胞兴奋时，膜外的Ca2+进入细胞内，同时又引起细胞内肌浆网中的Ca2+的进一步释放，胞浆内的Ca2+与钙调素（Calmodulin,CaM）或Leiotonin C结合，前者是一种具有四个钙结合位点的蛋白质，其氨基酸序列相当于磷酸激酶中的δ亚单位，而后者则是一种作用与肌钙蛋白C相近的蛋白质，这两种受体均存在于平滑肌细胞内。Ca2+与CaM结合形成复合物，激活肌凝蛋白的磷酸激酶，从而使20 KD的肌凝蛋白轻链磷酸化，这一反应再进一步使肌凝蛋白拉动肌纤蛋白而发生收缩。一般认为平滑肌细胞外的Ca2+可通过三种途径进入细胞内：1、经电压依赖性钙通道（potential dependent calcium channel,PDC）内流；2、经受体控制的钙通道（receptor operated calcium channel,ROC）内流；3、静息时的Ca2+内流，经此途径内流的Ca2+量很少，约相当于静息时膜上钙泵主动排出的Ca2+量。普遍认为细胞膜上的钙通道有上述三种，但也有学者认为除此之外还有一种对扩张敏感的Ca2+通道（stretch sensitive calcium channel）。    　　膀胱逼尿肌与其他类型的平滑肌一样，其收缩主要靠收缩性肌动蛋白和肌凝蛋白通过肌凝蛋白轻链激酶致肌凝蛋白轻链磷酸化。肌凝蛋白轻链磷酸化也依赖于平滑肌细胞内游离Ca2+浓度的升高，而细胞内游离Ca2+浓度的升高又来源于平滑肌细胞外Ca2+的移入和细胞内Ca2+的释放。膀胱逼尿肌的张力和膀胱内的压力与膀胱逼尿肌细胞的游离Ca2+浓度的高低密切相关〔5〕。膀胱逼尿肌细胞收缩时的这种细胞内的Ca2+的内流和细胞器的Ca2+的释放主要是M受体激动后所产生的〔6〕。    　　Margot〔7〕等通过对兔的膀胱逼尿肌的收缩性研究，发现正常兔膀胱逼尿肌细胞的收缩过程中，平滑肌细胞外的Ca2+是通过细胞膜上L型钙离子通道移入胞内的，同时膀胱逼尿肌细胞受刺激后部分Ca2+是从肌浆网释放的。有学者〔8〕发现近端尿道平滑肌细胞活动过程中呈现L和T型Ca2+通道的电生理及药理学特性。Sui〔9〕 等通过膜片钳技术对豚鼠膀胱逼尿肌细胞膜上的L和T型Ca2+通道进行了研究，发现急性酶法分离的单个平滑肌细胞胞膜上存在L和T型Ca2+通道，而分离后培养的平滑肌细胞胞膜上存在L型Ca2+通道无T型Ca2+通道。有学者〔10〕对人进行了研究同样发现膀胱逼尿肌细胞膜上存在L和T型Ca2+通道，膀胱逼尿肌细胞T型Ca2+通道激活的膜电位更接近膀胱逼尿肌细胞静息膜电位水平。认为T型Ca2+通道更易被激活，在膀胱逼尿肌细胞兴奋-收缩偶联中作用更大。有学者〔11〕通过实验发现，豚鼠膀胱逼尿肌细胞的自发性动作电位是通过L型钙离子通道的钙离子内流而产生，并认为该自发性动作电位是因机械性（如张力等）导致而非膀胱逼尿肌细胞内钙离子钙波动。从这些资料不难看出，膀胱逼尿肌细胞兴奋-收缩的机制尚未完全阐明，细胞膜上有那些与Ca2+通道的兴奋有关的通道还不得而知，待进一步研究。在临床中运用L型Ca2+通道阻滞剂治疗不稳定膀胱的尿频、尿急等症状疗效欠佳，我们认为是因为这一治疗并非病因性治疗。Frew 等〔12〕报道鼠膀胱逼尿肌的神经传递中Q钙离子通道起着作用。鼠膀胱逼尿肌经电刺激产生去甲肾上腺素及乙酰胆碱，连续性电刺激产生去甲肾上腺素及乙酰胆碱是通过阿托品敏感性机制，L、Q型钙离子通道均不同程度的参与毒蕈碱性受体调节的促进Ca2+的释放〔13〕。有学者〔14，15〕经实验发现β二丁酸佛波醇酯促进膀胱逼尿肌收缩是由于蛋白激酶C的磷酸化激活 L型钙离子通道所致，从而使细胞外Ca2+内流膀胱逼尿肌的收缩加强；同时他们发现P、Q Ca2+通道也参与了该过程，并认为是由于激活了嘌呤源神经传递。本系列研究发现静息状态下梗阻性不稳定膀胱组逼尿肌细胞内游离钙离子荧光强度明显高于正常对照组，说明细胞兴奋性增高，易出现膀胱逼尿肌的收缩，即不稳定膀胱。原因可能在于膀胱出口部分梗阻后膀胱内压力增高，膀胱壁张力随之而增高，至膀胱壁缺血、缺氧等病理生理改变膀胱逼尿肌细胞胞膜Ca2+通透性发生改变。其一细胞膜通透性增加，平滑肌细胞胞膜本身发生病理变化后Ca2+通道的通透性发生改变。本实验发现梗阻后膀胱逼尿肌细胞的兴奋性发生了改变，Ca2+通道通透性的改变在这一变化中起什么样的作用尚待进一步研究。另外，膀胱逼尿肌细胞胞膜的Ca2+通道的量发生了病理性增多,共聚焦显微镜及免疫组化均证实膀胱逼尿肌细胞膜存在N钙离子通道，且不稳定膀胱逼尿肌细胞膜之N钙离子通道数量明显增多。这一系列改变导致了膀胱逼尿肌细胞的兴奋性亦发生了变化，N钙离子通道的改变与静息状态下梗阻性不稳定膀胱组逼尿肌细胞内游离钙离子浓度增高，降低了膀胱逼尿肌细胞的兴奋域值，从而出现了膀胱的异常兴奋收缩，这样就产生了尿频、尿急甚至急迫性尿失禁。故膀胱逼尿肌细胞钙离子及其N钙离子通道病理生理性改变是出现不稳定膀胱的重要因素之一。

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　　13 Somogyi GT，Zernova GV，Tanowitz M：Role of L and Ntype Ca2+ channels in muscarinic receptormediated facilitation of ACh and noradrenaline release in the rat urinary bladder〔J〕.J Physiol，1997；15：499 (3):64554.

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