缺氧对膀胱平滑肌细胞缝隙连接蛋白表达的影响

作者：章振保，林 浩    作者单位：汕头大学医学院第二附属医院泌尿外科，广东汕头 515000

【摘要】  目的 通过研究膀胱出口部分梗阻及缺氧环境下膀胱平滑肌细胞中缝隙连接蛋白表达的变化，探讨不稳定膀胱的发生规律。方法 建立不稳定膀胱大鼠模型、体外正常大鼠膀胱平滑肌细胞并造成其细胞缺氧状态；采用RTPCR和Western blot分析膀胱平滑肌细胞的缝隙连接蛋白的表达。结果 不稳定膀胱组及缺氧组(15min、30min、1h)膀胱平滑肌细胞中Cx40、Cx43在mRNA及蛋白水平上均高于模型对照组及缺氧对照组(P<0.01)，其中缺氧15min组Cx43的mRNA及蛋白表达量均较缺氧30min组、缺氧1h组高(P<0.01)。结论 膀胱出口部分梗阻能引起平滑肌细胞缺氧与缝隙连接蛋白表达增多，平滑肌细胞缺氧也能引起缝隙连接蛋白表达增加。膀胱出口部分梗阻后导致的不稳定膀胱的发生可能与膀胱平滑肌细胞缺氧有着密切关系。

【关键词】  平滑肌细胞；细胞缺氧；不稳定膀胱；缝隙连接蛋白；膀胱出口梗阻

 (Department of Urology, the Second Affiliated Hospital,

    Medical College of Shantou University, Shantou 515000, China)ABSTRACT: Objective  To study the pathogenesis of unstable bladder with partial bladder outlet obstruction through the experiment based research on connexins in both unstable bladder group and cell hypoxia group. Methods  Unstable bladder rat models were established and smooth muscle cells were cultured in vitro. Then cell anoxia was induced. RTPCR and Western blot were used to quantify the connexins. Results  The mRNA levels of Cx40, Cx43 and the Cx43 protein expressed in the smooth muscle cells from the unstable bladder group and cell hypoxia groups were all higher than those in the control groups (the shamoperation group and normoxia groups) (P<0.01). In the cell hypoxia groups, cells exposed to 15min hypoxia expressed much higher Cx43 than the other two groups (P<0.01). Conclusion  Partial bladder outlet obstruction which leads to unstable bladder might cause cell hypoxia and the increased expression of connexins. In our study, cell hypoxia also increased the expression of connexins. Therefore, we conclude that cell hypoxia might play a key role in connecting partial bladder outlet obstruction and unstable bladder.

    KEY WORDS: smooth muscle cell; cell hypoxia; unstable bladder; connexin; bladder outlet obstruction

   膀胱出口部分梗阻将导致不稳定膀胱的发生[1]，其发病机制至今未明。在建立的实验动物模型中，膀胱出口部分梗阻能引起膀胱出现三个期的病理变化，依次为肥大增生期、代偿期和失代偿期。在肥大增生期间，虽伴随血管生长，但膀胱平滑肌细胞仍存在缺氧[2]。研究表明，膀胱出口部分梗阻后不稳定膀胱的发生，与缝隙连接蛋白具有密切的关系[34]。缝隙连接蛋白作为一种独特的蛋白通道，通过在相邻细胞间传递小分子第二信使、离子和代谢产物等，产生直接的电偶联和化学偶联效应[5]，与不稳定膀胱的发生密切相关。本实验在建立膀胱出口部分梗阻大鼠模型基础上取模型大鼠膀胱平滑肌细胞进行体外培养，同时，将正常大鼠膀胱平滑肌细胞在缺氧环境下培养造成细胞缺氧模型，通过RTPCR和Western blot等实验方法，在细胞水平检测缝隙连接蛋白的变化，探讨膀胱出口部分梗阻后发生的细胞缺氧与不稳定膀胱发生的关系。

    1  材料与方法

    1.1  实验对象  雌性Wistar大鼠60只，购自汕头大学医学院实验动物中心，体重200～250g，随机分为模型组30只，模型对照组10只，缺氧组10只，缺氧对照组10只。模型组大鼠建立膀胱出口梗阻(BOO)模型后行充盈性膀胱测压[3]，确定不稳定膀胱大鼠17只，模型对照组仅行尿道分离术而不结扎；缺氧组及缺氧对照组大鼠未做处理。模型组膀胱测压后抗生素腹腔注射3d，断颈法处死各组所有大鼠，于无菌环境下切除膀胱，分离浆膜层与黏膜层后，无菌生理盐水冲洗干净，采用组织块贴壁法[6]及差速贴壁法[7]分离培养膀胱平滑肌细胞，使用含150ml/L胎牛血清的DMEM培养基，在37℃、5%(体积分数)CO2环境下培养。

    1.2  细胞鉴定  第2代细胞行细胞鉴定后，第3代细胞用于实验。缺氧组细胞随机分为缺氧15min组、缺氧30min组和缺氧1h组，缺氧对照组细胞随机分为15min组、30min组和1h组。

    1.3  主要试剂  抗αSMactin抗体，购自博士德公司；总RNA提取试剂盒、一链合成试剂盒及PCR试剂盒均购自加拿大BBI公司；Cx40、Cx43及内参18S引物由上海基康生物技术有限公司设计合成；抗Cx43多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；生物素标记羊抗小鼠IgG购自Sigma公司；缺氧液按比例配制[8](mmol/L：NaCl[3]，KCl 12，MgCl2 0.4，CaCl2H2O 0.9, HEPES 4，乳酸钠20，蒸馏水500mL)后，调pH值至6.2，抽滤除菌后4℃保存。

    1.4  细胞鉴定  使用特异性抗αSMactin抗体(工作浓度1∶100，购自博士德公司)，将传代细胞悬液滴于盖玻片上，待细胞生长至80%～90%融合时取出，40g/L多聚甲醛固定20min后，Triton破膜20min，20mL/L小牛血清封闭30min，抗αSMactin抗体4℃孵育过夜，生物素标记二抗为羊抗小鼠IgG(工作浓度1∶200，购自Sigma公司)室温孵育1h，ABC(avidinbiotin complex 试剂盒购自美国Vector Laboratories公司)试剂反应30min，3，3二氨基联苯胺(3′ 3diaminobenzidine, DAB)显色，苏木素复染、脱水、透明、封片，空白对照组用1×PBS取代一抗，余操作相同。

    1.5  建立细胞缺氧模型  缺氧组细胞分为缺氧15min组、缺氧30min组、缺氧1h组，将各组细胞培养液倒干净后，无菌PBS冲洗三遍后将培养瓶烘干，加入提前用高纯氮气饱和30min的缺氧液，根据培养容器大小继续充入一定量高纯氮气以驱赶容器中剩余的空气，迅速密闭后放入缺氧盒中，置37℃、5%(体积分数)CO2培养箱培养15min、30min、1h。缺氧对照组细胞以培养基代替缺氧液，换液后在37℃、5%(体积分数)CO2环境下培养15min、30min、1h。

    1.6  RTPCR检测Cx40和Cx43  按照试剂盒说明书提供的步骤提取总RNA，合成一链后进行PCR反应。建立25μL扩增反应体系：cDNA 1μL、10×Master Mix 12.5μL、ddH2O 10.5μL、上下游引物各0.5μL。PCR反应条件为94℃预热5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，40个循环后72℃最后延伸6min。反应产物用10g/L琼脂糖凝胶电泳，并扫描入凝胶成像系统进行分析，结果以平均吸光度值(Cx/18S)表示。

    1.7  Western blot检测Cx43  提取细胞总蛋白后，将40μg蛋白经15g/L十二烷基硫酸钠聚丙稀酰胺凝胶(SDSPAGE)电泳分离后转移至硝酸纤维膜，50g/L脱脂奶封闭30min，1∶100一抗4℃孵育过夜，1∶500二抗室温孵育1h，ABC(avidinbiotin complex 试剂盒购自美国Vector Laboratories公司)试剂反应30min，用底物4氯1萘酚显色。显色结果吸光度扫描进电脑后，采用分析软件Quantity One进行分析。

    1.8  统计学方法  实验数据均以均数±标准差(±s)表示，模型组与模型对照组、缺氧组与缺氧对照组两组间对比采用配对t检验，缺氧组与缺氧对照组间比较用一元方差分析，P<0.01为差异有统计学意义。

    2  结    果

    2.1  RTPCR检测到平滑肌细胞中Cx40、Cx43的表达  结果显示Cx40、Cx43在4组细胞中均有表达。在凝胶成像系统中与18S比较，Cx40、Cx43在不稳定膀胱组中的表达较模型对照组有明显增加(图1)；在缺氧组15min、缺氧组30min、缺氧组1h中的表达亦较缺氧对照组15min组、30min组、1h组明显增加(图2)。各组间两者相比较差异具有显著性(P<0.01)。另外，Cx43在缺氧15min组的表达比缺氧30min组、缺氧1h组强，两者比较差异具有显著性(P<0.01)，缺氧30min组与缺氧1h组间差异无显著性。

    2.2  Western blot检测到的平滑肌细胞Cx43蛋白的表达  Cx43蛋白在所有细胞组中均有表达。不稳定膀胱组较模型对照组表达明显增加(图3)；缺氧组15min、缺氧组30min、缺氧组1h较缺氧对照组表达量亦明显增加(P<0.01)，缺氧15min时，Cx43表达量较缺氧30min、缺氧1h要高(P<0.01)，缺氧30min组与缺氧1h组之间差异亦无显著性(图4)，这些变化均与Cx43在mRNA水平上的变化一致。

    3  讨    论

    本实验通过造成不稳定膀胱动物模型，取模型大鼠膀胱平滑肌细胞进行原代培养，在细胞水平上进一步验证了膀胱出口部分梗阻引起的不稳定膀胱平滑肌细胞中，缝隙连接蛋白表达较对照组细胞显著增加。这与之前组织学上的实验研究结果基本一致[3]。梗阻引起不稳定膀胱发生的病理机制未明。近年研究表明，缝隙连接蛋白表达的增加可能是引起膀胱不稳定收缩的重要因素。缝隙连接蛋白是一种独特的通道。它通过在相邻细胞间传递小分子第二信使、离子和代谢产物等，产生直接的电偶联和化学偶联效应[5]。正常膀胱平滑肌细胞之间存在大量中间连接，而少见缝隙连接，在膀胱出口部分梗阻导致的不稳定膀胱中，中间连接明显减少而被大量缝隙连接取代[9]，但梗阻后如何引起缝隙连接蛋白表达的变化尚未明了[10]。

    目前，国内外尚未见到将细胞缺氧作为联系膀胱出口部分梗阻与缝隙连接蛋白表达增加的病理机制的相关研究。NAAMA等[11]研究发现，新生大鼠心肌细胞在缺氧环境下出现缝隙连接蛋白重构，并推测其与心律失常发生具有一定联系。LI等[12]发现缺氧引起Cx43发生明显的去磷酸化。CHEN等[13]也发现，在慢性缺氧条件下，大鼠的颈动脉小体和岩神经节中Cx43的表达亦相应增加。膀胱出口部分梗阻持续一段时间后，膀胱组织出现代偿性肥大，细胞增生，虽然伴随血管发生，但由于流出道阻力增大和残余尿量增加，使得膀胱逼尿肌压力升高并超过毛细血管压力，最终导致平滑肌细胞缺血缺氧[14]。在此基础上，通过实验，我们发现缺氧后与梗阻后膀胱平滑肌细胞缝隙连接蛋白表达均较缺氧对照组及模型对照组细胞表达增加(P<0.01)。有报道称，通过结扎尿道建立的鼠膀胱出口部分梗阻模型中，Cx43的基因转录和蛋白表达水平在结扎后7～9h达到最大值[4]。我们在实验中，将正常环境下培养的膀胱平滑肌细胞通过换入缺氧液并灌注高纯氮气造成细胞缺氧模型，观察膀胱平滑肌细胞在不同缺氧条件下(15min、30min、1h)缝隙连接蛋白表达的变化。实验发现，膀胱平滑肌细胞缺氧后能引起细胞缝隙连接蛋白表达的增加，并且在平滑肌细胞缺氧发生早期(15min)，缝隙连接蛋白表达已很活跃。虽然随着缺氧时间延长(30min、1h)，缝隙连接蛋白表达量有所下降，但仍较缺氧对照组细胞的表达有明显增加(P<0.01)，符合梗阻后膀胱平滑肌处于缺氧环境下发生不稳定收缩的病理变化过程。以此为据，我们推测膀胱出口部分梗阻后引起的膀胱平滑肌细胞缺氧是导致缝隙连接蛋白表达增加的重要因素。

【参考文献】[1]CHRIST GJ, DAY NS, DAY M, et al. Increased connexin43mediated intercellular communication in a rat model of bladder overactivity in vivo [J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2003, 84(5):12411248.

[2]GHAFAR MA, SHABSIGH A, CHICHESTER P, et al. Effects of chronic partial outlet obstruction on blood flow and oxygenation of the rat bladder [J]. J Urol, 2002, 167(5):15081512.

[3]章振保，周德荣，宋波. 不稳定膀胱与细胞间隙连接相关性的实验研究 [J]. 中华泌尿外科杂志, 2005, 26(11):755757.

[4]HAEFLIGER JA, TISSIERES P, TAWADROS T, et al. Connexin43 and 26 are differentially increased after rat bladder outlet obstruction [J]. Exp Cell Res, 2002, 274(2):216225.

[5]JOHN H, WANG X, WEHRLI E, et al. Evidence of gap junctions in the stable nonobstructed human bladder [J]. J Urol, 2003, 169(2):745749.

[6]KORKMAZ M, GUVENC BH, BILIR A, et al. Isolation and culture of adult and fetal rabbit bladder smooth muscle cells and their interaction with biopolymers [J]. J Pediatr Surg, 2003, 38(1):2124.

[7]HWANG JH, YUK SH, LEE JH, et al. Isolation of muscle derived stem cells from rat and its smooth muscle differentiation [J]. Mol Cells, 2004, 17(1):5761.

[8]JONASSEN AK, BRAR BK, MJOS OD, et al. Insulin administered at reoxygenation exerts a cardioprotective effect in myocytes by a possible antiapoptotic mechanism [J]. J Mol Cell Cardiol, 2000, 32(5):757764.

[9]ELBADAWI A. Pathology and pathophysiology of detrusor in incontinence [J]. Urol Clin North Am, 1995, 22(3):499512.

[10]SIBLEY GN. Development in our understanding of detrusor instability [J]. Br J Urol, 1997, 80(Suppl 1):5461.

[11]ZEEVILEVIN N, BARAC YD, REISNER Y, et al. Reisner Y. Gap junctional remodeling by hypoxia in cultured neonatal rat ventricular myocytes [J]. Cardiovasc Res, 2005, 66(1):911.

[12]LI WEI, NAGY JI. Connexin43 phosphorylation state and intercellular communication in cultured astrocytes following hypoxia and protein phosphatase inhibition [J]. Eur J Neurosci, 2000, 12(7):26442650.

[13]CHEN J, HE L, DINGER B, et al. Chronic hypoxia upregulates connexin43 expression in rat carotid body and petrosal ganglion [J]. J Appl Physiol, 2002, 92(4):14801486.

[14]GREENLAND JE, BRADING AF. The effect of bladder outflow obstruction on detrusor blood flow changes during the voiding cycle in conscious pigs [J]. J Urol, 2001, 165(1):245248.