膀胱肿瘤基因治疗研究进展

作者：邱天， 谭家莉， 袁建林 作者单位：解放军第101医院 普外科，江苏 无锡 214044    【摘要】  近年来，随着分子生物学及其相关学科的发展，基因治疗已经取得了非常大的进展，并且逐渐与传统的治疗手段相结合。在膀胱肿瘤基因治疗的研究上，人们也取得了许多重要的成果。本文主要综述了膀胱肿瘤基因治疗的主要方法，例如校正基因疗法、自杀基因疗法、耐药基因疗法等，同时对存在的问题也进行了概述。

【关键词】  基因治疗； 膀胱肿瘤； 耐药性； PTEN； p53

　　膀胱肿瘤是泌尿系统最常见的肿瘤[1]。在美国，膀胱癌是仅次于前列腺癌的泌尿系第二高发的恶性肿瘤[2]。1988年，我国统计膀胱肿瘤死亡率在男性肿瘤死亡率中居第8位，女性中居第10位。目前，膀胱肿瘤的治疗手段仍然采用手术为主化疗为辅的治疗方案，但其疗效仍不确定。膀胱癌的复发和转移率仍然很高，特别是对于晚期肿瘤、表浅膀胱癌以及有耐药性的原位膀胱癌。通过对人体的遗传物质进行修正、补充或改造，即可达到治疗疾病的目的，即“基因治疗”（gene therapy）。随着遗传学和分子生物学的进展以及基因的发现，人类基因治疗已成为现实。许多疾病例如膀胱癌[3]，其遗传密码和基因功能已经和细胞遗传物质的功能紊乱紧密联系。当前，许多研究都致力于肿瘤的基因治疗，而且有许多临床实验在世界范围内已经被认可，膀胱肿瘤也不例外。到目前为止，有关膀胱癌基因治疗的方案仍存在着多样性。

　　1  膀胱肿瘤的基因治疗方法

　　1.1  校正基因疗法  针对不同肿瘤的发生机制，按照基因修正、补偿、破坏的原理，采用生物学或物理化学的方法将正常的外源基因或特定的DNA片断导入肿瘤细胞内，达到逆转或阻止肿瘤生长、转移及复发的目的，即校正基因疗法。膀胱肿瘤的发生和发展与多种基因的突变有关，同时肿瘤细胞的凋亡及肿瘤的复发也可能涉及多个基因，其中包括抑癌基因PTEN，Rb，p53，p21，p16，p15以及癌基因CHaras，cmys，cerbβ2，MDR1等。将正常的抑癌基因转入膀胱癌细胞系及利用癌基因置换来控制或抑制癌基因表达，必然会导致癌细胞生长受阻，从而达到治疗膀胱肿瘤的目的。 RB和p53是被广泛研究的抑癌基因，在膀胱癌中p53基因异常最为多见。几乎有半数膀胱癌都与p53基因突变有关，其中又以表浅膀胱癌居多。而且，在膀胱癌的发生过程中，p53基因突变也扮演了一个很重要的角色。p53基因功能的丧失可导致早期肿瘤的发生并与肿瘤的恶性程度相关。Irie等[4]评估了105个日本膀胱癌病人p53基因突变的发生率和组织病理学的相关改变，以及病人的存活率。结果在38个膀胱癌病人中观察到了p53基因的突变(36%)，而且越到晚期或肿瘤的恶性程度越高，这种突变的发生率则越高。所有这些p53基因突变的病人，其存活率很低。由于p53基因有很强的抑制细胞生长及导致细胞凋亡的能力, 它已成为膀胱肿瘤基因治疗的主要候选基因。野生型p53基因能抑制多种缺乏p53基因和表达突变型p53基因产物的膀胱肿瘤细胞的增生。Wada等[5]把野生型p53基因转导入人体和鼠的膀胱癌细胞系(HTB9，KU1，和MBT2)中，然后把体外重组的腺病毒载体(Ad5CMVp53)注射到膀胱内，体外和体内试验的结果均发现：Ad5CMVp53能够明显抑制靶细胞的生长，且注射Ad5CMVp53后，宿主动物对肿瘤的耐受时间明显延长。目前，Ad5CMVp53载体正在被作为膀胱癌病人的生物药剂而用于一期临床试验阶段。这项研究的结果将为二期和三期临床试验提供基础 [6]。Rb基因是最早发现的一种抑癌基因,也是一个容易发生突变的抑癌基因。在Rb家族中，膀胱癌的发病率较高。野生型Rb基因置换可抑制Rb缺陷肿瘤细胞的致癌性。 Rb基因的失活不仅存在于散发性膀胱癌中，同时也存在于具有Rb基因介入的膀胱癌细胞系中，其结果使癌细胞缓慢增生。Xu等[7]观察Rb基因校正疗法治疗膀胱癌的效果：由腺病毒载体转染膀胱癌细胞，与对照组相比，Rb基因转染后，瘤细胞DNA合成明显下降，从而导致细胞生长率下降。

　　p16是一种新型抑癌基因，人类75%的癌细胞株有p16的缺失或突变，超过了p53基因50%的突变率。在多种原发瘤和细胞系中，p16基因存在较高频率的突变和缺失，恢复肿瘤细胞中正常p16基因功能是抑制肿瘤增殖的一种手段。p16基因的变异不仅在肿瘤的发生中发挥作用，而且与肿瘤的转移相关。Grim等[8]用腺病毒载体将野生型p16基因转入p16阴性的人膀胱癌细胞系（EJ及UMUC3），结果肿瘤增值受到明显的抑制。p21基因同p16基因一样为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子，它是p53基因的下游作用因子。尽管p21的异常表达与膀胱癌的复发及存活有密切关系，但是p21基因治疗的相关研究还很少。PTEN是1997年三个研究小组几乎同时发现的一个基因，它不仅表现为抑癌基因的特性，而且还具有磷酸酶活性，在细胞内信号传导路径的调控中起关键作用。在肿瘤发生中，癌基因常因突变和杂和性丢失（LOH）而改变其生物学特性，因而被灭活。Cairns等[9]检测285例膀胱癌肿瘤标本，发现10q有较高的缺失率，65例（23%）在10q存在LOH，其中4例存在纯和性丢失。对25例膀胱癌测序，发现有2例存在10q23的突变。他们发现10q的LOH在Ta期为8%，T1期20%，T2期为29%，对于10q出现LOH的膀胱癌肿瘤大约有14%由于PTEN突变而灭活。随着研究的深入，PTEN的独特作用及蛋白的失活机制会越来越清楚，它在膀胱肿瘤的基因治疗中将会起到重要作用。Ras基因功能异常对于膀胱癌的发生和进展同样重要。Watanabe 等[10]把人类膀胱癌细胞植入裸鼠体内，然后经尿道在膀胱内接种表达有Hras隐性突变体（N116Y）的腺病毒，用一个包含有β半乳糖激酶基因(AdCMVLacZ)的腺病毒载体作对照，把N116Y基因(AdCMVN116Y)作为治疗载体，以研究AdCMVN116Y对膀胱癌细胞系（KU7及UMUC2）体外生长的抑制作用以及对植入裸鼠体内的两个细胞系的抑制作用。体外生长实验显示：和AdCMVLacZ比较，经AdCMVN116Y处理过的靶细胞出现明显的生长抑制作用(＞95%)。经尿道把AdCMVN116Y植入膀胱内，可以明显减小人类膀胱肿瘤组织的体积(73%~90%)并降低其数量(47%~78%)。上述几种校正基因治疗均对膀胱肿瘤有不同的疗效，说明了这种方法具有很大的发展空间，但目前进行最多的还是p53基因治疗膀胱肿瘤的相关研究。

1.2  免疫基因疗法  免疫基因治疗即采用一定的方法或载体将目的基因导入肿瘤细胞或效应细胞肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，然后将表达目的基因的受体细胞输入患者体内，通过提高人体免疫系统对肿瘤进行治疗的一种方法。目前主要有两种途径：(1)针对免疫应答细胞的治疗，即用细胞因子基因转染抗癌免疫应答细胞,如TIL、细胞毒性Ｔ细胞(CTL)可增加其抗癌活性,可供选择的目的基因有白介素(IL1，2，4，6，12等)、干扰素(IFNα和β等)、肿瘤坏死因子(TNF)、集落刺激因子(GCSF、GMCSF)等。尤其是IL2基因转导接种疗法引导着整个肿瘤生物免疫治疗的发展方向。(2)由于肿瘤能逃避机体的免疫防御系统，因此可以针对肿瘤细胞进行治疗。免疫基因治疗还包括用痘苗病毒载体(VV)介导部分癌胚抗原(CEA)基因转染受体细胞，以增强免疫原性。通过鼠源性膀胱癌比较研究发现，IL1和INFｒ基因作用微弱，IL4和GMCSF较强，IL2基因的作用最强。鼠源性膀胱移行细胞癌(MBT2)的病因、病理学和对常规治疗的反应与人膀胱癌极为相似，因此常用作模型研究。Connor等[11]用MBT 2细胞在同源鼠(C3H)建立原位膀胱癌模型,然后转IL 2基因治疗膀胱癌。研究发现在60%的鼠中，膀胱肿瘤消失，动物存活时间远高于顺铂治疗组。而且，给已治愈动物的膀胱壁内注射种植MBT  2细胞，结果无肿瘤再形成。而对照组却导致膀胱肿瘤形成，尽管对照组注射的MBT  2细胞数比实验组少5倍。这表明经IL 2转基因治愈的动物体内产生了保护性抗肿瘤免疫记忆。Hashimura等[12]将膀胱肿瘤（MBT 2）接种到皮下，然后分两组，分别全身应用IFNλ或体内直接转移IFNλ基因，对比两种方法的抗肿瘤效应。与全身应用相比，基因转移方法能显著降低肿瘤生长速度，延长无瘤生存期和提高总的生存率。将病毒抗原编码基因插入带有强启动子的质粒载体，然后导入肿瘤细胞，即成为基因疫苗。基因疫苗的突出优点是能通过不同途径诱导产生细胞毒T淋巴细胞（CTL）。由于CTL反应对控制病毒感染和抗肿瘤免疫起着重要作用。因此基因疫苗在诱导抗肿瘤免疫方面比常规疫苗更具有优势。基因疫苗诱导产生肿瘤特异性的抗体和CTL的事实，已在动物实验得到了广泛证实，它对人类肿瘤治疗与预防的有效性和安全性，是未来研究的重点。Larchian等[13]将转染IL2或B71的疫苗用于鼠膀胱癌动物模型的MBT2肿瘤细胞系，无瘤生存率明显提高。膀胱癌CEA的表达率在某些研究中高达41%，使得基因疫苗在治疗膀胱癌方面有广阔的前景[14]，CEA基因疫苗的研究最近已进入临床试验阶段[15]。第2期膀胱肿瘤基因治疗研究进展  邱  天，等免疫基因治疗膀胱肿瘤在许多方面已经有了很大的发展，某些疫苗甚至可以产生持久的免疫力。但是，到目前为止，大多数治疗方案仍处于动物试验阶段。

　　1.3  自杀基因疗法  自杀基因疗法是1986年Frederid Moolten首次描述，作为一种新兴且最具潜力治疗肿瘤的方法，这种疗法是利用转基因技术，将哺乳动物细胞中不含有的自杀基因转入肿瘤细胞中，该基因表达的产物可将无毒的药物前体转化为有毒的药物，影响肿瘤细胞的遗传物质合成，最终引起细胞死亡。目前研究最多的是HSVtk/GCV系统(单纯疱疹病毒胸腺嘧定核苷酸激酶/ganciclovir)和CD/5FC系统(胞嘧啶脱氨酶/5氟胞嘧啶)。HSVtk杀伤肿瘤细胞主要是通过催化一些与核苷类似的药物如GCV磷酸化，这些药物不能在细胞tk基因作用下磷酸化，因而其本身对细胞的毒性很低。在导入HSVtk并能有效表达的肿瘤细胞中，这种药物可被磷酸化而抑制细胞DNA的合成。 Akasaka等[16]利用化学药物诱发小鼠发生膀胱肿瘤，然后用膀胱灌注法把带有HSVtk的腺病毒导入鼠膀胱中，接着注入GCV，3 d 之后，肿瘤细胞发生了明显的空泡变性，14 d 之后，肿瘤生长被明显抑制，并且可观察到腺体化生。另外， Freund等[17]使人类巨细胞病毒（CMV）和劳氏肉瘤病毒（RSV）均装载tk基因，以比较它们的疗效和毒性。体外试验结果显示：在规定期限内ADV/CMVtk所杀死的细胞数目是ADV/RSVtk的4倍。而体内试验显示：ADV/CMVtk的每一病毒都有三重抗肿瘤效果，而ADV/RSVtk效果较弱，且大剂量的ADV/CMVtk有肝毒性。这说明小剂量的ADV/CMVtk有明显的抗肿瘤效应。自杀基因治疗肿瘤的作用不仅在于转染的细胞“自杀”，而与其邻近的未转染的细胞也可被杀死，即所谓的“旁观者效应”。有研究认为，当10%的肿瘤细胞被转染tk基因，既可出现明显的旁观者效应，甚至杀伤全体细胞。叶传忠等[18]对逆转录病毒介导Hytk基因治疗膀胱癌进行实验研究，发现GCV不仅能杀伤转入tk基因的细胞,而且对其周围未转基因的膀胱癌细胞存在旁观者效应， tk阴性的肿瘤细胞也被杀死，其杀伤率可达到89%，而且此效应并无细胞株间的特异性。旁观者效应可以弥补基因治疗中载体转染效率低和转染后表达少等方面的不足。  

　　目前，有关运用CD/5FC系统治疗膀胱癌的研究进行得还很少，大多数研究都是针对HSVtk/GCV系统进行的。这可能由于HSVtk/GCV系统比较适合膀胱肿瘤的治疗。但目前这些研究中大部分仍基于动物模型。近几年已经出现了一些新型自杀基因治疗方法用于治疗转移性膀胱肿瘤。例如溶解肿瘤的疱疹载体G207的应用则有可能有效的治疗转移性肿瘤。

　　1.4  耐药基因疗法  化疗药物有明显抑制肿瘤细胞生长的作用。但是，某些类型肿瘤细胞对化疗药物存在固有的耐药性，或在治疗过程中获得耐药性，甚至是多药耐药性(MDR)。耐药基因用于基因治疗主要从两个方面着手：第一，用反义RNA或DNA使MDR1基因灭活，从而缓解肿瘤化疗的耐药性,提高化疗的疗效。第二，将MDR基因导入造血干细胞，增强造血系统抵抗化疗药物的骨髓抑制作用的能力。如：将MDR1的反义核苷酸导入具有耐药性的白血病细胞，培养一段时间后这种细胞对阿霉素和正定霉素的抗药性明显下降。最近，Hesdorffer[19]等已将MDR1基因用于临床，他们将患者自体移植的造血干细胞导入含MDRcDNA的逆转录病毒载体，然后把这种转染细胞与非转染细胞一同回输给患者，结果在5个患者中观察到2个患者的MDR1基因存在稳定表达，而且并未发现其它不利情况，这说明MDR基因用于临床治疗已具有一定的安全性和可行性[19]。目前,临床试验已开始用MDR基因转入转移性膀胱癌病人的骨髓细胞中，并接受MVAC(氨甲叶酸/长春碱/阿霉素/顺铂)标准全身化疗的考验。　1.5  反义基因疗法  反义基因疗法(antisense gene therapy)是指应用反义核酸在转录或翻译水平阻断某些异常基因的表达。目前，反义核酸已应用于许多领域(包括肿瘤、遗传性疾病、血管性疾病、病毒性疾病),成为有别于传统治疗方法的基因治疗新手段。近年来,膀胱肿瘤反义核酸治疗已广泛开展，取得了可喜的成果。如：针对cmyc翻译起始区的15聚反义寡脱氧核苷酸，可有效地抑制人膀胱癌细胞DNA合成，p62表达减少，致瘤性下降；反义转化生长因子（TGFβ1）重组质粒，可使鼠膀胱肿瘤细胞的克隆形成能力减弱。说明消除TGFβ1的免疫抑制作用，增强机体抗肿瘤免疫反应是肿瘤基因治疗的有效策略。uPA在人膀胱肿瘤中含量增多，而用反义寡核苷酸抑制uPA基因表达,可使肿瘤转移能力减弱。反义基因治疗已成为一种有效的膀胱肿瘤治疗方法。

　　2  基因治疗存在的问题

　　目前，基因治疗已成为肿瘤治疗领域内研究的热点，而膀胱肿瘤的治疗也不例外。基因治疗的方法虽然多种多样，但仍存在较多的问题和缺陷，因而影响了膀胱肿瘤的治疗效果。现已报道的绝大多数膀胱肿瘤临床基因治疗方案中，用于抗肿瘤的目的基因只有一个，而单基因治疗肿瘤临床效果不理想，局限性很大，相比之下，多基因联合治疗具有更大的合理性与优越性，是肿瘤基因治疗发展的必然方向。主要原因是肿瘤细胞癌变扩散后，性质发生复杂变化，人体免疫等生理机制又有了缺损，而一种抗肿瘤基因作用不够强大且单一有限，往往无法抑制住肿瘤细胞增殖，难以取得治疗效果。而使用两种或多种基因联合治疗肿瘤，则可充分发挥抗肿瘤基因间相互协同作用，显著增强抗肿瘤效果。如：HSVtk基因分别与IL2，IL4，IFNα基因联合转染肿瘤，则可加强对肿瘤的抑制作用，而HSVtk基因与细胞因子基因IL2，GMGSF三者联合转染效果则更好。膀胱肿瘤基因治疗临床试验效果不理想，最关键的问题是缺乏具有导向性的高效载体系统。目前常用的基因转移载体缺乏选择性，肿瘤细胞和正常细胞均可被感染，且治疗肿瘤的目的基因有的有杀伤性或毒副作用，正常组织细胞被感染会遭受损伤。因此提高基因转移的靶向特异性，才能实现治疗的针对性和安全性,肿瘤基因治疗才会取得突破，因为基因疗法所使用的逆转录病毒系统没有特异性。Pan等[20]描述了一种载体方案：人体端粒酶逆转录酶(hTRT)的启动子可特定地影响端粒酶阴性细胞附近的少数端粒酶阳性的肿瘤细胞。把一个包含有Cre/loxP特异位点的重组体整合入载体中，这种载体将破坏端粒酶阳性、p53阴性的肿瘤细胞，而少数正常细胞是端粒酶阳性，且带有野生型p53基因（例如有活性的淋巴细胞）。这种载体方案特别适合于膀胱移行细胞癌，这是由于其很容易扩散进入尿道以及局部高复发的特点，同时此肿瘤的端粒酶活性非常高，且p53基因功能是紊乱的。基因转移载体是决定肿瘤基因治疗临床效果的关键,理想的转移载体除应具备靶向特异性外，还应具有转移效率高、安全性好、稳定性强、容量大等特点。虽然当转基因组成功表达进靶细胞时，治疗基因是很活跃的，然而却不能够一直维持足够的转导率。目前，已有多种策略可提高膀胱癌细胞治疗基因的转导效率，这些策略包括对腺病毒纤维的修改，能提高病毒易感物质的共同转导作用，以及对粘多糖（GAG）层的破坏[21]。

　　3  展望    　　膀胱肿瘤的基因治疗已经获得了许多令人满意的效果，目前也是世界范围内许多学者研究的热点。近些年来，基因转染的方法在不断地改进，而膀胱肿瘤发生的分子机制也在不断的研究中。基因疗法不断改善，其治疗效果也就会越来越好。某些方法如转移PTEN来抑制膀胱肿瘤的生长或转移，以及膀胱癌基因疫苗的研究，都说明了此方面的进展。膀胱肿瘤基因治疗具有很大潜力，在取得成果的同时，我们也要认识到上述各种问题及不足，从而针对这些问题而有目的地进行解决，这样基因治疗才会得到更大的发展。

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