利用PCR反应检测肾结核病人尿标本结核菌的探讨
发表时间：2009-07-02 浏览次数：667次
作者：项小丰，刘燕 【关键词】 结核菌；肾结核；聚合酶链反应
摘 要：目的 探讨聚合酶链反应（PCR）检测肾结核病人尿标本结核菌的特异性。方法 采用PCR方法检测。结果 10例肾结核病人尿标本PCR阳性率为80％，10例非结核泌尿系统感染病人尿标本PCR检查结果均为阴性。结论 PCR敏感性强，与临床符合率高，是一种较为理想的检验方法。
关 键 词：结核菌；肾结核；聚合酶链反应
自1985年以来美国的Mutllis等首创的聚合酶链反应技术（PCR）已在许多领域得到了应用，并被证明是一种高效、特异敏感、快速的分子生物学技术［12］。我们利用PCR技术对10例尿检菌阳性或手术病理确诊的肾结核病人术前尿标本进行了检测，初步探讨了PCR技术的临床应用价值，以及开展此项技术需注意的几个问题。
1 材料与方法
1.1 材 料
肾结核病人10例，分别来自北华大学附属医院、吉林市中心医院、吉林市化工二院；10例肾结核病人中2例尿检抗酸菌阳性，7例经手术切除、病理切片证实为肾结核，2例经保守抗结核治疗症状缓解，1例放弃治疗。10例非结核性泌尿系统感染病人来自北华大学附属医院和吉林市中心医院住院确诊病人(尿培养出非结核性致病菌)。正常对照组5人，为本院工作人员。所有人留24 h尿，取沉淀部分200 ml送检。
人型粗糙有毒标准结核菌株（H37RN）DNA引物及DNA标准模板阳性对照由白求恩医科大学免疫研究室提供。扩增仪为北京ACI公司9700型基因扩增仪。
1.2 方 法
1.2.1 样品处理
取样品各1.5 ml；1000 r/min离心3 min，弃去沉淀，上清移入1．5 ml Ep管；各样品1400 r/min 再离心10 min，去上清，沉淀用TrisCl(pH8．0)液洗涤一次，1400 r/min 离心10 min；去上清各管加入TrisCl EDTA(含10％Trition-X 100 50 μl，溶菌酶100 μg/ml)，混匀；37.0℃ 3 h，100℃ 10 min，6000 r/min离心l0 min，备用［3］。
1.2.2 DNA扩增
在50 μl体系中加去离子水6 μl，dNTP 4 μl，5×buffer l0 μl，引物10 μl，96℃ 10 min变性后；加入Taq酶10 μl，最后加100 μl液体石蜡，放入扩增仪内进行扩增；94℃ 1 min，65℃ 1 min，72℃ 2 min，共35个循环，最后72℃延伸10 min。
1.2.3 扩增结果观察
0.5 TBE，2％琼脂糖凝胶电泳，电压100 V，电流约15 mA，电泳时间45 min；EB染色30 min，紫外线下检测。以人型粗糙有毒标准结核菌株（H37RN）DNA标准模板为阳性对照。扩增产物呈现164 bp扩增带为阳性。反之为阴性。
2 结 果
10例确诊的肾结核病人尿标本PCR检测8例阳性，阳性率80％（P<0.0l），10例非结核泌尿系统感染病人均为阴性，5例正常对照尿标本均为阴性。10例肾结核病人尿检抗酸菌2例阳性，阳性率20％。
3 讨 论
泌尿系统结核的诊断目前常根据临床反复发作或难以治愈的泌尿系统感染，静脉尿路造影或逆行肾盂造影发现典型X线影像学改变才能确立。少数病人用抗酸染色检菌或结核茵培养尿中可找到结核菌，但阳性率太低，且结核菌培养麻烦费时，一般医院不做常规开展。所以反复迁延的血尿成为临床的一大难题，病人常被延误诊断时机。本实验10例肾结核病人尿标本PCR检测阳性率80％，非结核泌尿系统感染病人尿标本10例均阴性的。PCR检测结果与尿涂片检抗酸杆菌阳性率有明显差异，本组确认的10例病人均多次做涂片抗酸菌检测，仅2人出现阳性，阳性率20％。而PCR阳性率80％。结果显示PCR检测方法敏感性好，特异性强，不失为提高临床确认率的好方法。由于PCR方法敏感性高，有假阳性的可能，因此要特别注意标本之间的污染，所用的用具应一次性使用，若必须重复使用的需严格消毒处理。其次尿标本的采集必须取24 h尿，否则取样太少可能将尿中结核菌漏掉。标本的前处理也很重要需严格掌握实验条件，破壁不完全和DNA链被破坏均可造成假阴性。
参考文献：
［1］ 王建春, 高博, 黄文红, 等. 聚合酶链反应结合地高辛标记寡核苷酸杂交检测肠道致病菌的应用［J］. 中华传染病杂志, 2006, 24(3): 161－162.
［2］ 李泽松, 李建新, 张文, 等. 聚合酶链反应在α地中海贫血诊断中的应用［J］. 中华检验医学杂志, 2005, 28(3): 247－250.
［3］ 郑永晨, 潘国强. PCR检测技术中模板DNA的简易快速提取法［J］. 白求恩医科大学学报, 1993, 19(4): 36－37．
