尿脱落细胞Tenascinc mRNA检测在膀胱癌诊断

作者:谢胜,郝丽娜   【关键词】  膀胱肿瘤；尿脱落细胞；Tenascinc；逆转录聚合酶链反应(RTPCR)    Tenascinc(TNC)是由单基因编码的细胞外基质糖蛋白分子，主要来源于间质细胞，一些上皮细胞中也能合成，在胚胎时期各种组织中均有广泛的表达，在成熟组织中没有或仅有少量的表达，在多种肿瘤组织中都有突出的表达[1]。我们通过检测膀胱肿瘤患者尿脱落细胞中TNC的表达情况来揭示其在膀胱肿瘤诊断中的价值。    1  资料与方法    1.1  临床资料  收集膀胱癌患者(均经病理活检确诊)尿液32例，男26例，女6例，年龄30-79岁，按TNM分期标准Ta 1例，T1 14例，≥T2 11例，按WHO分级标准，G1 12例，G2 9例，G3 5例；前列腺增生症22例，年龄56-76岁，其中合并膀胱炎患者16例(诊断标准为尿液分析提示白细胞>5个/HP)；健康志愿者5例。    1.2  试剂  总RNA提取试剂盒和DNA Marker购自上海华舜生物工程有限公司，5u/μL的Taq聚合酶和dNTP混合物(各10mmol/L)购于大连宝生物工程公司，TNC引物由上海博亚生物技术有限公司合成，引物设计参照文献[2]，P1：5TCCTGCTGACTGTCACAATC3′，P2：5TGCTCACATACACATTTGCC3。    1.3  尿液的收取和标本的制备  无菌操作留取每位实验者清晨尿150mL，其中100mL立即离心(4000r/min)沉淀，PBS液洗涤2次再离心后，-70℃冰箱保存，余下50mL作尿细胞学检查。    1.4  尿脱落细胞TNC mRNA检测  使用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction, RTPCR)检测尿脱落细胞TNC mRNA。各步反应按试剂盒说明进行，随后将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后在Gel DOC 1000紫外检测系统中观察结果并储存图像后进行灰度值测定。    1.5  尿脱落细胞学检查  将收集的另外50mL尿液标本经过离心沉淀后取沉淀物涂片，及时用100mL/L乙醇固定后采用苏木素－伊红(Hematoxylin and Eosin, HE)染色法，以发现肿瘤细胞为阳性，其余为阴性。    1.6  统计学方法  应用SPSS10.0软件进行分析。    2  结    果    2.1  TNC mRNA检测结果  32例膀胱癌患者中有26例尿脱落细胞中约在250bp附近检测出TNC基因条带(242bp)，阳性率81.3%，合并膀胱炎的16例前列腺增生症患者中有11例尿脱落细胞中检测到TNC基因表达，特异性为59.3%，健康志愿者未检出该基因的表达(图1)。    图1  尿脱落细胞的TNC扩增产物琼脂糖凝胶电泳图    M：DNA Marker；1：分化Ⅰ级膀胱癌患者；2、8：合并膀胱炎的前列腺增生症患者；3、4、9：分化Ⅱ级膀胱癌患者；5：为分化Ⅲ级膀胱癌患者；6：为浸润性膀胱癌患者；7：为浅表性膀胱癌患者；10：健康志愿者    2.2  灰度值  TNC阳性膀胱炎患者TNC平均灰度值低于分化Ⅰ级膀胱癌患者，但差别无统计学意义(P>0.05)，膀胱癌患者TNC平均灰度值随膀胱癌的分级的增高而升高，各级之间TNC平均灰度值存在统计学差异(P<0.05，表1)。浅表性膀胱癌与浸润性膀胱癌患者TNC灰度值之间存在统计学差异(P<0.05，表2)。    2.3  尿脱落细胞学检查结果  32例膀胱癌患者中，12例尿脱落细胞学检查阳性(37.5%)，正常人和良性病变患者检查结果均为阴性，特异性为100%。表1  膀胱炎、分化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级膀胱癌患者TNC平均灰度值表2  26例TNC基因阳性浅表性膀胱癌与浸润性膀胱癌患者TNC灰度值中位数    3  讨    论    目前临床上诊断膀胱癌的主要手段仍然依赖于膀胱镜下取材活检和尿脱落细胞学检查，膀胱镜和活检是诊断膀胱癌的金标准，但其为有创检查，用于筛查膀胱癌患者受到很大的限制，尿脱落细胞学检查特异性高，文献报道总特异性为94%-100%，但其敏感性低，一般来说低于50%，特别对于早期低级别患者仅为30%，本研究中只有37.5%，且易受主观因素的影响，这就限制了它单独应用于膀胱癌的诊断。由于尿路上皮肿瘤的凋亡、坏死和脱落可使其部分细胞成分直接释放入尿液中，故寻找尿液中潜在的瘤标已成为尿路上皮肿瘤无创性诊断的一种趋势[3]。

 TNC是由单基因编码的细胞外基质(extracellular matrix, ECM)糖蛋白分子，其编码基因位于9号染色体q32-34上，具有复杂的分子结构，在动物胚胎发育过程中多种组织中表达，在成熟组织中没有或仅有少量的表达，TNC的功能强大而复杂，参与胚胎多种组织的发育及神经的损伤再生、组织的创伤修复、肿瘤发生等过程。研究表明，TNC在乳腺癌，膀胱癌等多种肿瘤组织中都呈高表达，在体内可促进肿瘤细胞扩散,加速肿瘤侵袭性生长[45]。刘红君等[6]报道在膀胱肿瘤组织中TNC的表达明显上调，且和肿瘤的分级分期成正相关，这和Booth等[7]的研究相一致，膀胱肿瘤患者尿脱落细胞TNC的表达情况尚未见相关报道。    本研究表明，高分级(G2,G3)的膀胱癌尿脱落细胞TNC的表达强度明显高于低分级的膀胱癌，说明肿瘤细胞的异型程度越高，TNC的表达越强，另一方面，浸润性膀胱癌(T2-T3)的TNC的表达程度也明显高于浅表性膀胱癌，说明膀胱癌的侵袭性越高，TNC的表达也就越高，这些结果提示TNC的表达在膀胱癌的恶性进展过程中起着重要的作用。Jahkola等[8]认为TNC作为一种抗黏附分子，其在乳腺癌中的表达尤其在癌巢浸润边缘的表达预示将发生远处转移，其对无转移生存率的评估作用优于肿瘤的大小及分级,在膀胱癌中的表达是否也提示如此有待我们进一步研究证实，如果得到证实，那么研究TNC在膀胱癌中的表达对临床上治疗方法的选择和判断预后则更有意义，尤其对于术后复发的监测，如果膀胱癌患者的肿瘤级别提高，则可能提示预后不良。    膀胱癌的早期发现对患者的预后相当重要，而尿脱落细胞学检查对G1、G2相对更不敏感，基于用RTPCR方法检测尿脱落细胞TNC的表达敏感性高这一特点，且取材方便，无侵入性操作，又不受主观因素影响，检测尿脱落细胞中TNC的表达可以用于临床对膀胱癌患者的筛查工作，如果再结合患者的临床表现和尿脱落细胞学检查，这对于能用无创方法提高早期肿瘤的检出将大有帮助。    由于存在假阳性，尿脱落细胞TNC的检测对于膀胱癌并不能完全确诊，一般认为，假阳性的出现大部分与膀胱炎、尿道创伤和泌尿系其他肿瘤有关，因泌尿系其他肿瘤相对于膀胱癌来说很少见，而且本检测方法为无创检查，由此可以知道假阳性的出现主要与膀胱炎有关。我们注意到，膀胱炎患者尿脱落细胞中TNC的表达强度和G1膀胱癌患者的表达强度无明显差异(P>0.05)，而与G2、G3膀胱癌患者的表达有明显差异(P<0.05)。这就提示我们，如果标本量足够，我们就可能设定一表达界值，最大限度地排除假阳性而提高特异性，这对膀胱癌的诊断无疑是有帮助的。    另外，对于泌尿系其他肿瘤我们在收集标本时虽然尽量排除，但仍不能完全排除在尿脱落细胞中出现这方面的肿瘤细胞，我们此次研究主要针对泌尿系统中最常见的移行细胞癌，且由于移行细胞癌的预后差异较大，也是我们泌外工作者研究的热点，由于条件所限，我们未能进一步研究其他类型的肿瘤，有待于今后进一步探讨。    当然，检测膀胱癌患者尿脱落细胞中TNC的表达仅是一初步的研究，它的临床应用价值尚需更多的基础和临床研究以及时间来验证。TNC作为一种重要的细胞外基质糖蛋白分子，其强大复杂的功能推测是由各片断相对独立的功能共同体现出来的，在今后的研究中若能明确其促进肿瘤细胞浸润和转移的功能域，这对将来应用分子生物学技术来治疗膀胱癌能提供新的思路,TNC受体的研究也具有重要的理论意义，将为TNC复杂多样功能的分子机制研究提供线索,随着对TNC的深入研究，其潜在的临床价值必将得到体现，正如Booth[7]所说，TNC可能将成为一种新的膀胱肿瘤诊断工具。【参考文献】[1]Atula T, Hedstrom J, Finne P, et al. TenascinC expression and its prognostic significance in oral and pharyngeal squamous cell carcinoma [J]. Anticancer Res, 2003, 23(3C):30513056.[2]MaulardDurdux C, Housset M. Prognostic factors of infiltrating tumors of the bladder [J]. Cancer Radiother, 1998, 2(suppl 1):511.[3]李涛，王颖，陈梓莆，等. 尿细胞角蛋白在上尿路移行细胞癌诊断中的应用 [J]. 现代泌尿外科杂志, 2005, 10(2):7475.[4]Kalembeyi I, Inada H, Nishiura R, et al. TenascinC upregulates matrix metalloproteinase9in breast cancer cells: direct and synergistic effects with transforming growth factor beta1 [J]. Int J Cancer, 2003, 105(1):5360.[5]Gazzaniga P, Nofroni I, Gandini O, et al. Tenascin C and epidermal growth factor receptor as markers of circulating tumoral cells in bladder and colon cancer [J]. Oncol Rep, 2005, 14(5):11991202.[6]刘红君，王佳丽，赵建忠，等. 膀胱移行细胞癌中Tenascinc表达的研究 [J]. 济宁医学院学报, 2006, 29(3):1922.[7]Booth C, Harnden P, Selby PJ, et al. Towards defining roles and relationship for tenascinc and TGF beta1 in the normal and neoplasmic urinary bladder [J]. J Pathol, 2002, 198(3):359368.[8]Jahkola T, Toivonen T, Von Smitten K, et al. Expression of teanascin in invasion border of early breast cancer correlates with higher risk of distant metastasis [J]. Int J Cancer, 1996, 69(6):445447