甘氨酸对肾缺血再灌注损伤的保护作用及对iNOS表达
发表时间：2009-06-19 浏览次数：787次
作者:潘寿华,谢立平
【关键词】 肾缺血 肾缺血再灌注损伤的病理机制非常复杂，研究资料表明，iNOS的过表达参与缺血再灌注损伤病理过程。本研究主要通过检测大鼠缺血后尿量变化、尿生化和肾功能，结合常规病理检查、电镜观察及免疫组化法测定iNOS蛋白表达变化，探讨甘氨酸对肾脏热缺血再灌注损伤的保护作用及作用机制。 1 资料与方法 1.1 实验动物与试剂 健康雄性Wistar大鼠24只，体重(250±18)g，购自中科院上海实验动物中心。随机分为假手术组(A组)、对照组(B组)、甘氨酸治疗组(C组)。甘氨酸购自上海生物工程技术有限公司，iNOS免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程公司。 1.2 肾缺血再灌注动物模型的制作 2%戊巴比妥钠60mg/kg腹腔注射麻醉，大鼠仰卧位于恒温手术台上，左股静脉插管，接微泵输注生理盐水(A、B组)或甘氨酸溶液(C组)，速度1mL/(100g·h)。膀胱造瘘，接预先称重的1.5mL微量离心管，收集尿标本。计算尿量变化。输注液体60min后，行腹部正中切口，无损伤动脉夹阻断肾蒂30min。假手术组不上夹。于再灌注30、60、90、120min留取尿标本。2h后断尾取血0.5mL。再灌注至24h，取门静脉血3mL，切取双肾。HE(苏木素伊红)常规染色，光镜检查，按paller标准评分。电镜检查，免疫组化法检测iNOS表达水平。 1.3 指标观察 ①记录再灌注后30、60、90、120min的尿量；②日立全自动生化仪检测再灌注2、24h血肌酐(Cr)、血尿素氮(BUN)浓度；③苏木精伊红染色后光学显微镜下观察其组织形态学变化；④透射电镜观察其超微结构变化；⑤免疫组化法(Envision二步法)检测iNOS的表达水平，iNOS阳性反应结果为胞浆及胞核中有棕黄色颗粒。高倍镜下(×400)每片随机取5个视野，每个视野计100细胞，计算阳性细胞数。阳性细胞数为0记作(-)，阳性细胞数<25%为(+)，25%-50%为()，50%-75%为()，>75%为()，并将反应强度依次评为0-4，求±s。 1.4 统计分析 采用SPSS统计软件进行统计学分析，数据以均数±标准差(±s)表示。定量数据先行正态性检验(u检验)，再进行方差齐性检验，组间比较用StudentNewmanKeul法。组织学评价采用Wilcoxon法。P<0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 尿量变化 再灌注60min对照组尿量开始明显增加，60、90、120min分别与假手术组比较差异有显著性(P<0.05)。甘氨酸治疗组再灌注30min尿量开始明显增加，30、60、90min与对照组比较差异有显著性(P<0.05，表1)。表1 大鼠急性缺血后尿量(mL)的变化与B组比较#P<0.05, *P<0.01 2.2 再灌注2、24h血肌酐、尿素氮浓度变化 2h血尿素氮及肌酐浓度对照组高于假手术组，差异有显著性(P<0.05)，而2h甘氨酸治疗组血肌酐低于对照组，尿素氮高于对照组，差异均有显著性(P<0.05)。24h血肌酐、尿素氮浓度对照组高于假手术组，甘氨酸治疗组低于对照组，差异均有显著性(P<0.05，表2)。表2 大鼠急性缺血后血肌酐、尿素氮变化与B比较#P<0.05, *P<0.01 2.3 肾组织病理学检查 假手术组大鼠肾脏HE染色未发现明显的形态学改变。光镜下对照组近曲小管上皮细胞空泡变性和坏死，肾小管腔扩张并可见管型和细胞坏死脱落，累及近曲小管所有细胞；可见明显管周血管的扩张淤血，间质中性粒细胞浸润。甘氨酸治疗组近曲小管上皮细胞部分肿胀、颗粒变性和小空泡变性，罕见细胞坏死和管型。Pallet评分甘氨酸治疗组低于对照组。 2.4 肾组织透射电镜检查 对照组线粒体明显肿胀变形，细胞内排列不齐，嵴稀疏断裂，有的失去正常内部结构而成为均匀-团，基底褶及刷状缘微绒毛减少消失，细胞浆内变性严重，区域溶酶体增多，粗面内质网扩张成大小不一的囊泡。甘氨酸治疗组线粒体轻度肿胀，嵴损伤较轻，细胞内排列整齐，细胞基部可见质膜反褶，细胞游离缘微绒毛丰富，个别细胞溶酶体略多，内质网和高尔基体轻度扩张或正常。
2.5 肾组织iNOS蛋白表达水平 iNOS表达细胞在胞质或胞核中着色，呈弥漫性或棕黄色颗粒。对照组与假手术组相比iNOS表达明显增加，而甘氨酸治疗组iNOS表达明显低于对照组。采用高倍视野记数法结果显示对照组iNOS蛋白免疫反应强度明显高于假手术组，而甘氨酸治疗组iNOS蛋白免疫反应强度明显低于对照组。 3 讨 论 甘氨酸是人体内最简单的非必需氨基酸，是肌酸、谷胱甘肽、嘌呤和卟啉等合成的主要原料之一，在体内有很重要的生理作用。1973年国外就有学者发现低到中等剂量的甘氨酸可引起肾血管扩张及GFR的增加，对肾缺血再灌注损伤有保护作用。然而，迄今为止甘氨酸对肾功能保护作用的机制尚未阐明。Weinberg等[1]发现甘氨酸能增加肾近曲小管细胞耐受缺氧损伤，保护作用不依赖细胞内ATP水平，和氨基酸的代谢无关，认为高度特异的受体和配体的作用在维持细胞的完整性上起关键作用。Baines等[2]在离体灌注肾模型研究中发现甘氨酸的保护作用不需代谢，与稳定膜蛋白的三级结构有关。Mauriz等[3]认为甘氨酸的保护作用有多种机制参与，如抑制NFkB的活性来抑制iNOS的表达、抑制某些细胞因子释放、保护线粒体呼吸链功能、减少氧自由基的产生等。Iijima等[4]认为甘氨酸能抑制氯离子通道的活性，减少氯离子的内流，从而减少钙和钠离子的内流，防止钙超载的发生。 本实验结果表明，甘氨酸能增加大鼠肾缺血再灌注损伤后的尿量，增加尿肌酐的排出，增加内生肌酐清除率，减少再灌注后24h血肌酐、尿素氮的升高，再灌注后尿量增多可能由于继发于GFR的增加而肾小管的重吸收功能及尿的浓缩功能障碍未恢复所致。肾组织学检查和电镜检查结果表明甘氨酸能减轻近曲小管的损伤，线粒体和内质网肿胀变形明显轻于对照组，表明甘氨酸对大鼠肾脏缺血再灌注损伤有-定的保护作用。 肾缺血再灌注损伤与多种因素有关，而内皮源性的一氧化氮所介导的内皮功能障碍是启动肾缺血再灌注损伤的重要机制之一。缺血性肾损害大鼠的肾组织中iNOS表达量显著增高，直接导致肾小管上皮细胞损伤，从而使肾功能受到损害[5]。iNOS是引起缺血性肾损害发生的重要因子[6]，如果在肾缺血再灌注损伤中采用一些干预措施抑制iNOS过量表达，就会在一定程度上对缺血性肾损害产生保护作用[7]。目前已发现多种iNOS的抑制剂，部分在临床中使用并已取得良好的效果。Mauriz等[3]在研究缺血性休克所致大鼠肝损害模型中发现甘氨酸能显著抑制iNOS过量表达，并认为这是甘氨酸保护缺血性肝损害的机制之一。本组实验中，对照组iNOS的表达明显高于假手术组，而甘氨酸治疗组iNOS的表达明显低于对照组，也说明了甘氨酸对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的保护作用与抑制肾组织中iNOS的表达有关。但甘氨酸通过何种途径抑制iNOS的表达目前还不完全明确，有待进一步研究。【参考文献】 [1]Weiberg JM, Venkataehalam MA, GarzoQuintero R, et al. Structural requirements for protection by small amino acids against hypoxic injury in kidney proximal tubules [J]. FASEB J, 1990, 4(15):33473354. [2]Baines AD, Shaikh N, Ho P. Mechanisms of perfused kidney cytoproteetion by alanine and glycine [J]. Am J Physiol, 1990 (259):8087. [3]Mauriz JL, Matilla B, Culebras JM, et al. Dietary glyeine inhibits activation of nuclear kappa B and prevents liver injury in hemorrhagic shock in the rat [J]. Free Radical Biology ＆ Medicine, 2001, 31(10):12361244. [4]Iijima S, Sbou J, Naama H, et al. Beneficial effect of enteral glycine in intestinal ischemia/reperfusion injury [J]. J Gastrointestinal Surgery, 1997,
