阿托伐他汀对Aβ142诱导AD模型抗凋亡作用的研究

　　作者：张媛媛 李晓红 王敏 王栋 作者单位：(山东大学附属济南市中心医院神经内科，山东 济南 250013)

　　【摘要】 目的 探讨阿托伐他汀对Aβ142诱导阿尔茨海默病(AD)大鼠模型学习记忆功能及神经细胞凋亡的影响。方法 采用侧脑室注射Aβ142的方法制备大鼠痴呆模型，阿托伐他汀5 mg·kg-1·d-1灌胃为治疗组，并设假手术组作为对照组。水迷宫实验观测大鼠的行为学变化，免疫组织化学方法测定海马区caspase3的表达，尼氏染色观察海马区神经元凋亡情况，透射电镜观察海马区神经元超微结构的变化。结果 模型组大鼠的学习记忆成绩下降，半胱氨酸蛋白酶3(caspase3)生成增多(P<0.01)，凋亡神经元增多;阿托伐他汀治疗组与模型组大鼠相比较，学习和记忆成绩有所改善，海马区caspase3生成减少(P<0.01)，凋亡神经元减少。细胞形态学观察显示，与模型组相比，阿托伐他汀治疗组模型海马区神经细胞损伤减轻。结论 阿托伐他汀可以减少AD大鼠模型海马区caspase3的生成，减少神经元的凋亡，减轻神经细胞损伤，改善其学习和记忆能力。

　　【关键词】 阿尔茨海默病;阿托伐他汀;大鼠;caspase3;凋亡

　　他汀类(statins)药物是近10年开发的三羟基三甲基戊二酰辅酶A 还原酶(HMGCoA) 抑制剂，其主要药理作用是抑制胆固醇合成的限速酶HMGCoA还原酶。大规模的临床调查表明，他汀类药物可以明显降低阿尔茨海默病(AD)的发病率，减缓AD的进展，其机制尚未完全清楚。本实验通过研究阿托伐他汀干预caspase3的产生、神经元的凋亡以及细胞形态学的变化，探讨他汀类药物防治AD的可能机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 试剂和仪器 阿托伐他汀(立普妥，生产批号：75837005)由辉瑞公司生产;Aβ142为Sigma产品;羊抗鼠caspase3单克隆抗体为Santa Cruz产品;免疫组化试剂盒SP9003，购自北京中杉金桥生物技术有限公司;甲苯胺蓝为Sigma产品;脑立体定位仪由山东大学解剖教研室提供，西安万东机械制造厂生产;Morris水迷宫由中国医学科学院药物研究所研制;JEM1200EX型透射电子显微镜，日本电子公司生产。

　　1.2 动物分组 选用体重在300～350 g的健康雄性Wistar大鼠60只，购于山东大学医学院实验动物中心。购入后，在实验室饲养5 d后进行实验，固体饲料和水自由摄取。将大鼠完全随机分为对照组，模型组，他汀对照组和治疗组，每组15只。

　　1.3 模型制备及给药 用无菌生理盐水将Aβ142稀释成5 μg/μl，37℃孵育72 h 变为聚集状态置于4℃备用。将大鼠麻醉成功后，固定于脑立体定向仪上。头顶部正中切口，以前囟为原点，向后0.8 mm，旁开1.3 mm，为穿刺点，钻孔穿颅，自脑表面进针3.6 mm至侧脑室，用微量注射器将Aβ1422 μl(10 μg) 缓慢注入，留针10 min。退出针后，缝合伤口。对照组和他汀对照组注射等体积的生理盐水。术前对照组和模型组生理盐水2 ml/d灌胃，他汀组对照组和治疗组阿托伐他汀用生理盐水溶解为1 mg/ml后以5 mg·kg-1·d-1灌胃3 w。术后继续上述灌胃至动物处死。

　　1.4 取材及标本制作 术后24 h 4组各随机处死5只动物，麻醉成功后4%多聚甲醛心脏灌注固定，断头取脑，4%多聚甲醛固定，常规石蜡切片，切片免疫组化染色。术后1 w同样方法4组各随机处死4只动物，切片免疫组化染色及尼氏染色。同时各组随机选取1只动物，麻醉后快速取脑，剥离海马，自CA1区切取2 mm ×2 mm ×1 mm 脑组织块，作为电镜标本。

　　1.5 学习记忆能力检测 术后每天观察动物的反应、活动情况等。采用参照中国医学科学院药物研究所设计的Morris水迷宫，直径130 cm，高50 cm，水温保持在20℃。于术后第21天对4组动物各5只进行水迷宫训练，每天上午、下午各训练1次，连续5 d。①定位航行实验(place navigation)：按东北、西北、东南、西南四个象限依次将大鼠面向池壁放入水中，设定最长游动时间为120 s，记录大鼠找到平台所需的时间，记作逃避潜伏期，此项检测动物的学习能力。②空间探索实验(spatial probe)：撤掉平台，选定和平台相对的象限中点为入水点，记录120 s内大鼠为搜索平台二穿过原平台放置区域的时间与总游泳时间的比例，以及穿过平台区的次数，此项检测动物的记忆能力。数据采集和处理由Morris水迷宫图像自动监视处理系统完成。

　　1.6 海马区电镜超微结构检查 标本在2%戊二醛固定72 h，1%锇酸固定1 h，梯度丙酮脱水,，EPon812包埋，超薄切片机切片，醋酸铀、柠檬酸铅双重染色。置于透射电镜下观察神经细胞的损伤情况和胶质细胞情况。

　　1.7 尼氏染色 每只大鼠取3张切片，脱蜡至水，65℃ 0.3%甲苯胺蓝中浸染20 min，95%酒精分化，100%酒精脱水，二甲苯透明后封片，置于光镜下观察。在400倍光镜下选取海马CA1区5个有代表性的不重叠的视野，统计每个视野的黑细胞数，将所得均数作为每只动物的黑细胞数作为统计资料。

　　1.8 免疫组化染色法检测海马区细胞caspase3的表达 每只大鼠取3张切片分别进行caspase3(1∶100)的免疫组化染色，按照免疫组化染色试剂盒步骤进行染色。观察方法均采用阳性细胞记数法，在400倍光镜下选取海马CA1区5个有代表性的，不重叠的视野，统计每个视野的阳性细胞数，将所得均数作为每只动物的阳性细胞数作为统计资料。

　　1.9 统计学方法 所有计量资料用x±s表示 ，采用SPSS13.0软件包进行两组间t检验和多组间单因素方差分析(F检验)。

　　2 结果

　　2.1 水迷宫实验 模型组与对照组相比较，学习和记忆成绩均显著降低(P<0.01)。他汀对照组与对照组相比较，学习和记忆成绩差异无显著性。他汀治疗组与模型组相比较，学习和记忆成绩均显著升高(P<0.01)。见表1。

　　2.2 尼氏染色 术后1 w对照组大鼠海马区神经细胞排列整齐紧密，胞浆中尼氏小体着色清楚。他汀对照组与对照组无明显变化。模型组海马区神经细胞层次明显减少，细胞排列稀疏，可见大量凋亡细胞。他汀治疗组凋亡细胞较模型组明显减少，与模型组比较差异显著(P<0.01)。如图1。凋亡细胞数目(x±s)：对照组4.9±2.69，他汀对照组4.1±3.14，模型组51.4±7.36，他汀治疗组13.3±5.09，他汀治疗组与模型组相比差异显著(P<0.01)，模型组与他汀对照组相比差异显著(P<0.01)。

　　表1 各组大鼠水迷宫试验的学习和记忆成绩比较(略)

　　与对照组相比：1)P<0.01;与模型组相比：2)P<0.01

　　图1 术后1 w各组大鼠海马区尼氏染色(×400)(略)

　　2.3 超微电镜 对照组大部分神经元结构正常，胞核常染色质为主、核圆，细胞内可见丰富的细胞器。他汀对照组镜下亦大部分神经元均正常。模型组神经元大部分神经元衰退，细胞固缩，胞核椭圆形，细胞内高尔基体及内质网均肿胀，线粒体基质呈低电子密度，细胞质基质呈高电子密度，胞质中充满核糖体。胶质细胞比正常组多，胞质内可见髓样体。他汀治疗组与模型组相比，神经元损伤较轻，衰退神经元较少，胶质细胞较少(图2)。

　　2.4 海马区caspase3表达 结果见表2，图3。对照组和他汀对照组海马区细胞caspase3阳性细胞均较少，两者差异不显著。模型组与对照组比较，阳性细胞较多，差异显著(P<0.01)。他汀治疗组与模型组比较，阳性细胞减少，差异显著(P<0.01)。

　　图2 术后1 w大鼠海马区超微电镜观察(×5 000)(略)

　　图3 术后24 h各组大鼠caspase3抗体免疫组化染色(×400)(略)

　　表2 各组大鼠海马CA1区caspase3免疫组化阳性细胞数比较(略)

　　与对照组比较：1)P<0.01;与模型组比较：2)P<0.01

　　3 讨论

　　AD是一种以认知功能损害为主要临床表现的进行性退行性疾病,老年人发病率较高。AD是一种多因素疾病，其发病机制尚不完全清楚，Aβ的沉积是AD重要的病理学特征，Aβ淀粉样沉积导致神经细胞凋亡一直被认为是AD的发病机制之一。

　　GomezIsla等〔1〕发现AD患者的脑内神经元的缺失较正常老年人严重，而多个体外研究证实Aβ能够导致神经细胞凋亡〔2，3〕，从而推测AD患者脑内神经细胞凋亡较多与体内Aβ沉积有关。细胞凋亡是一个动态的可调节过程，受一系列凋亡相关基因的调控。在细胞凋亡的机制研究中,目前提出了两条主要信号途径，即线粒体途径和死亡受体途径〔4〕。caspase家族是一组位于细胞凋亡线粒体途径调控机制核心、具有天门冬氨酸特异性的半胱氨酯蛋白酶。激活的caspase通过对细胞特异性蛋白质的剪切达到快速有序的“杀死”细胞。caspase3是该家族重要成员，是中枢神经疾病及损伤中细胞死亡及功能丧失的重要调制与执行者，它们的产生标志着组织损害的病理学变化〔5〕。Zhang等〔6〕的研究表明Aβ是通过增强caspse3的活性导致神经元凋亡的。本实验的结果与已往的研究一致，模型组中Aβ142导致脑内caspase3产生增多，神经元凋亡明显。

　　大规模的临床调查表明，他汀类药物可以明显降低AD的发病率，减缓AD的进展，具有防治AD的作用〔7，8〕。阿托伐他汀是他汀类降脂药中的代表药物，Sparks等〔8〕的研究结果显示阿托伐他汀对轻中度的AD患者有明显的智能改善作用。其机制可能与他汀类药物可以减少脑中胆固醇的形成〔9〕，影响淀粉样前体蛋白(APP)的代谢，改善血液供应〔10〕，抗炎〔11〕，阻断异戊二烯化过程〔12〕等有关。

　　Carloni等〔13〕的研究显示辛伐他汀减少低氧局部缺血脑损伤大鼠脑内caspase3的产生，减少神经元的凋亡，从而起到脑保护作用。本研究结果显示，他汀对照组与对照组结果均无显著差异，阿托伐他汀本身对正常脑组织无特殊作用;大鼠AD模型给予阿托伐他汀治疗后，学习及记忆能力明显改善;经阿托伐他汀治疗后，术后24 h大鼠AD模型海马区caspase3产生明显减少;术后1 w时尼氏染色显示他汀治疗组与模型组相比，凋亡细胞较少;两组caspase3产生均较24 h减少，但他汀治疗组仍较模型组少。表明阿托伐他汀减少AD大鼠模型脑中caspase3的产生，减少神经元的凋亡，改善大鼠的学习和记忆能力。推测阿托伐他汀具有上述作用的机制可能有如下几点：①与其减少脑中胆固醇的产生有关〔9〕;②与其抗炎作用有关〔11〕;③阻断异戊二烯化过程〔12〕有关。

　　本实验通过体内试验证实阿托伐他汀对AD有治疗及预防作用，其抗神经元凋亡作用可能为机制之一，为阿托伐他汀在AD防治中的应用提供了一定的理论依据。目前对于他汀类药物的多效性作用及其机制仍存在争议，其抗凋亡的作用机制有待进一步探讨。

　　【参考文献】

　　1 GomezIsla T，Price J，McKeel D,et al.Profound loss of layer II entorhinal cortex neurons occurs in very mild Alzheimer′s disease〔J〕.J Neurosci，1997;16(14):4491500.

　　2 Eldadah BA，Yakovlev AG，Faden AI.The role of CED3related cysteine proteases in apoptosis of cerebellar granule cells〔J〕.J Neurosci,1997;17(16):610513.

　　3 Allen JW，Eldadah BA，Faden AI.Betaamyloidinduced apoptosis of cerebellar granule cells and cortical neurons：exacerbation by selective inhibition of group I metabotropic glutamate receptors〔J〕.Neuropharmacology，1999;38(8):124352.

　　4 Hengartner MO.The biochemistry of apoptosis〔J〕.Nature，2000;407(12)：7706.

　　5 Pike BR，Flint J，Dave JR,et al.Accumulation of calpain and caspase3 proteolytic fragments of brainderived aIIspectrin in cerebrospinal fluid after middle cerebral artery occlusion in rats〔J〕.J Cereb Blood Flow,2004;24(1):98106.

　　6 Zhang Y，Cynthia Goodyer，Andre′a LeBlanc.Selective and protracted apoptosis in human primary neurons microinjected with active caspase3，6，7，and 8〔J〕.J Neurosci，2000;20(22):83849.

　　7 Wolozin B，Kellman W，Ruosseau P,et al.Decreased prevalence of Alzheimer disease associated with 3hydroxy3methylglutary1 coenzyme A reductase inhibitors〔J〕.Arch Neurol，2000;57(10):143943.

　　8 Sparks DL，Sabbagh MN，Connor DJ,et al.Atorvastatin therapy lowers circulating cholesterol but not free radical activity in advance of identifiable clinical benefit in the treatment of mildtomoderate AD〔J〕.Curr Alzheimer Res，2005;2(3):34353.

　　9 Frears E，Stephens D，Walters C,et al.The role of cholesterol in the biosynthesis of betaamyloid〔J〕.Neuroreport，1999;10(8)：1699705.

　　10 Hofman A,Ott A，Breteler M,et al.Atherosclerosis，apolipoprotein E，and prevalence of dementia and Alzheimer′s disease in the Rotterdam Study〔J〕.Lancet，1997;349(9046):1514.

　　11 Youssef S，Stuve O，Patarroyo JC,et al.The HMGCoA reductase inhibitor，atorvastatin，promotes a Th2 bias and reverses paralysis in central nervous system autoimmune disease〔J〕.Nature，2002;420(6911):7884.

　　12 Cordle A，Landreth G.3Hydroxy3methylglutarylcoenzyme A reductase inhibitors attenuate betaamyloidinduced microglial inflammatory responses〔J〕.Neuroscience，2005;25(2)：299307.

　　13 Carloni S，Mazzoni E，Cimino M,et al.Simvastatin reduces caspase3 activation and inflammatory markers induced by hypoxiaischemia in the newborn rat〔J〕.Neurobiol Dis，2006;21(1):11926.