过氧化物酶体增殖物激活受体δ+294T/C基因多态性与冠心病的关系

作者                 单位

常虹        安徽省立医院干部病房干三病区,合肥,230001

王龙飞      安徽省立医院干部病房干三病区,合肥,230001

谈敏        安徽省立医院干部病房干三病区,合肥,230001　

冠心病(冠状动脉粥样硬化性心脏病)是动脉粥样硬化(atherosclerosis， AS) 导致器官病变的最常见类型，遗传、糖脂代谢、单核-巨噬细胞、细胞因子等在其中起着重要作用[1]，PPARδ的功能与这些作用密切相关。PPARδ基因的启动子及5'非翻译区包含该基因表达的重要调节区，在这些部位核苷酸的变化会导致其mRNA和蛋白水平改变，最终影响PPARδ靶基因的表达。外显子4+294T/C基因多态性邻近此区域，通过对PPARδ基因在该位点的功能多态性研究以探讨PPARδ基因在糖脂代谢及AS发生、发展过程中的作用。

1 资料与方法

1.1 研究对象及分组 本研究所选对象均来自安徽医科大学附属省立医院2008年1月至2008 年5月门诊健康体检者及住院患者，按其临床特征分为两组。冠心病组: 共120 例， 安徽汉族，其中，男性78 例，女性42 例，平均年龄(66.3 ±10.1) 岁，以上病例临床表现及心电图变化均符合中华医学会心血管病学分会等制定的冠心病诊断标准[2]，均经选择性冠状动脉造影术判断至少有一处狭窄，且>50%(直径法)，不排除患有高血压及2型糖尿病，但排除痛风及肿瘤患者。对照组: 共82 例，安徽汉族，其中，男性47 例，女性35 例，平均年龄(64.5±7.0) 岁，为本院体检的健康人群，无冠心病临床表现、心电图正常，排除原发性高血压、冠心病、痛风、肿瘤等患者。两组性别、年龄差异无统计学意义，确认人群之间无血缘关系。

1.2 临床资料收集、常规检查及生化检验 体质量、身高由专门人员测量，体质量指数(BMI) = 体质量/身高2 (kg/m2)，≥25为肥胖。

检测空腹血糖(FBS，氧化酶法)、三酰甘油 (TG) 、总胆固醇(TC) 、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C) 、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)，以上指标均在研究对象禁食12 h后于清晨抽取静脉血，在日本日立7600 型全自动生化分析仪上进行测定。

血浆胰岛素浓度用放射免疫法(合肥众成公司药盒) 检测，评价胰岛素敏感性的方法采用HOMA公式，胰岛素抵抗指数(HOMA IR) = FBS ×FINS/ 22.5( FBS 表示空腹血糖，单位mmol/L ，FINS 表示空腹胰岛素，单位mU/L) 。

1.3 测定PPARδ+294T/C基因多态性方法 取静脉血2 ml，EDTA抗凝，-80 ℃冻存。用德国QIAGEN公司试剂盒抽提外周白细胞基因组DNA，以基因组DNA为模板进行PCR扩增。引物设计参考国外有关文献[3]，上游引物: 5′- CATGGTATAGCACTGCAGGAA-3′;下游引物: 5′-CTTCCTCCTGTGGCTGCTC-3′。25 μl PCR反应体系含:模板DNA 150 ng，引物各0.5 μl(10 μmol•L-1)，dNTPmix 0.5 μl(10 mmol•L-1)， Taq酶2.5 U(PROMEGA) ，10 ×PCR 缓冲液2.5 μl，MgCl 21.5 μl(25 mmol•L-1)及去离子水补齐。反应条件为:95 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s ，35个循环，最后72℃延伸10 min。然后PCR产物进行内切酶消化，限制性核酸内切酶BSLⅠ酶切位点：

5'- C C N N N N N↓N N G G - 3'

3'- G G N N↑N N N N N C C - 5'

20 μl反应体系含：PCR 产物17 μl ，BSLⅠ10 U(上海生工) ，10×Tango Buffer 2 μl，55 ℃水浴消化8 h。最后进行电泳分析:取全部酶切产物， 2%琼脂糖电泳，90V电泳35 min。PPARδ基因的扩增长度为269 bp， BSLⅠ酶切后可出现三种片段组合:CC 型为167 bp和102 bp;TC型为269 bp，167 bp， 102 bp;TT型仅为269 bp。随机抽取三种基因型PCR产物各两样品送测序鉴定(上海生工)。

1.4 统计学处理 通过凝胶电泳结果判读个体基因型，计算各组样本基因型频率，等位基因频率计算采用平衡法: C = CC + 1/2 TC，T = TT + 1/2 TC，并经Hardy-Weinberg平衡检验以确认样本是否具有群体代表性。临床计量资料中，正态分布数据采用均数±标准差表示，非正态分布数据取其对数，正态化后进行分析。计量资料多组间比较用方差分析(one-wayANOVA 法);计数资料组间比较采用χ2检验，统计学处理用SPSS 11.5软件包完成， P<0.05 示差异有统计学意义。用逐步Logistic 回归分析了解不同基因型与CHD的关系，关联程度用比值比(odds ratio，OR)及95%可信区间表示(CI)。

2 结果

2.1 PPARδ+294T/C 基因型分析 PCR扩增基因片段长度为269 bp，其中一段序列5'-TCCTGTAGAGG-3'，5'端第1位碱基即PPARδ基因的外显子4+294位点[4]，当5'端第1位碱基的T突变为C后，可被限制性核酸内切酶BSLⅠ识别并酶切，从而形成限制性片段长度的多态性。如果当两个基因拷贝该位点均是T时，则称为TT 型，若均为C，则称CC型;若一拷贝是T，另一拷贝是C，则为TC型。实验中所用引物扩增PCR产物的长度为269 bp ，当用1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后，可见清晰的DNA条带出现，分子量约为269 bp，与预期结果一致，产量及特异性均好。进行基因型的分析时，所有样本均进行BSLⅠ酶切并用2%琼脂糖电泳凝胶成像仪上观察电泳结果(图1) ，酶切完全而且DNA条带清晰。

1为PCR产物;2为CC型;3、6为TT型;4、5为TC型;7为DNA Marker

图1 PPARδ+294T/C基因多态电泳图

其中CC型为167 bp 和102 bp两个电泳条带;TC型含有269 bp，167 bp，102 bp三个电泳条带;TT型则仅有269 bp一个DNA电泳条带。随机抽取三种基因型PCR产物测序鉴定与PCR产物酶切电泳结果一致(图2)。

①为TC型;②为TT型;③为CC型

图2 PPARδ+294T/C基因型的PCR 产物测序结果

2.2 冠心病组与正常对照组PPARδ+294T/C基因型频率及等位基因频率比较(表1) 对两组基因型频率进行平衡检验，均符合Hardy-Weinberg遗传平衡，故认为能够代表群体的基因分布。两组基因型分布差异有统计学意义(χ2=7.661，P=0.022);CHD组TC+CC基因型(C等位基因携带)频率高于NC组(χ2=6.339，P=0.012);两组间C、T 等位基因频率分布差异有统计学意义，CHD组C等位基因频率高于NC组(P <0.05)。

2.3 冠心病组PPARδ基因多态性与各临床数据的关系(表2)

2.3.1 冠心病组PPARδ+294T/C基因多态性与各临床资料、生化指标比较:冠心病组基因型分析发现CC基因型7例，因例数少与TC基因型合并成TC+CC 组。统计结果显示，各基因型之间年龄、体质量、身高、体质量指数、空腹血糖、血脂、胰岛素抵抗指数差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3.2 PPARδ+294T/C基因多态性与冠心病危险因素的多因素logistic 回归分析: PPARδ+294T/C基因型在冠心病伴发病影响见表3。结果显示PPARδ+294T/C基因多

态性与是否合并原发性高血压、2型糖尿病无显著性关联。将性别、肥胖、血脂异常、血糖异常、高血压病病史、2型糖尿病病史、“C”等位基因携带(TC+ CC基因型)等因素作为自变量，冠心病作为应变量，引入非条件logistic 回归方程，发现“C”等位基因携带者冠心病的危险性高于TT基因型(P<0.05)，“C”等位基因携带者(TC+CC) OR=3.16，(95%CI :1.39～7.14)。

3 讨论

PPARs属于核受体超家族成员，为配体激活的转录因子。PPAR与维甲酸X受体(retinoid X receptor ，RXR)结合为异二聚体，配体结合后被激活，在释放共抑制蛋白并结合辅激活蛋白后形成包含多亚单位的协同激活物，与靶基因启动子区域过氧化物酶体增殖物反应元件(peroxisome prolifeator response element，PPRE)结合，发挥对脂质代谢、炎症等靶基因的转录调控作用[5]。

3.1 PPARδ+294T/C多态性的分布 本研究对象为202例安徽地区汉族冠心病及健康体检者，结果显示C等位基因频率分别为0.308、0.195。在Aberle等[6]及Chen等[7]研究中冠心病者C等位基因频率分别为0.24、0.21，这可能与PPARδ基因分布存在种系差异有关。该研究两组间PPARδ+294T/C基因型分布频率及等位基因分布频率中差异有统计学意义(P< 0.05) ，说明在冠心病及正常人群中该基因位点基因型频率分布及等位基因频率分布中差异有统计学意义。

3.2 PPARδ基因多态性与冠心病的关系 Oliver等[8]利用PPARδ合成的激动剂GW501516对肥胖恒河猴进行4周治疗后研究发现， 其血脂谱明显改善，PPARδ在脂质代谢机制中起重要作用。来源于WOSCOPS(苏格兰西部冠脉预防研究)表明，580名男性中C等位基因携带者HDL血浆浓度显著降低，其中纯合子有冠心病高风险倾向[9]。Aberle等发现，在混合性高脂血症的967例女性患者C等位基因与低血浆HDL水平之间有显著的关联性，C等位基因与冠心病及代谢综合征之间也显著关联，即使在体质量指数在中位数以下体瘦对象中关联性也明显[10]。Chen等人研究发现多态位点为+294T/C其与高加索人群中总胆固醇、三酰甘油[11]及高加索男性LDL-C[11]HDL-C[7]相关。位于PPARδ基因5′端非编码区外显子4的+294T/C基因多态性与瑞士及荷兰男性人群的胆固醇代谢相关 [12]。众多资料表明，PPARδ激活可以增加骨骼肌、脂肪组织脂肪酸转运和氧化，提高血浆HDL胆固醇以改善致动脉粥样硬化血脂障碍，通过多途径抑制血管炎症，从而发挥抗动脉粥样硬化作用[5]。

本研究中PPARδ+294T/C基因多态性与冠心病患者血糖、血脂、BMI及胰岛素抵抗指数没有显著性的关联，与Shin等[13]报道不一致。这可能与样本量较小及纳入对象行调脂降糖治疗有关。本研究提示PPARδ+294T/C基因多态性与冠心病之间有重要的相关性。这可能与PPARδ+294T/C基因多态性影响转录因子Sp-1的结合，C等位基因携带的转录活性明显增高从而导致PPARδ作用于血管壁局部，参与动脉粥样硬化的形成有关[12]。

总之，本研究结果提示， PPARδ+294T/C基因多态性与冠心病相关，“C”等位基因携带可能是冠心病的危险因素，其具体机制尚待扩大样本量进一步研究。

【参考文献】

[1] Fruchart JC ， Duriez P ， Staels B. Peroxisome proliferators-activated receptor-alpha activators regulate genes governing liporprotain metabolism， vascular inflammation and atherosclerosis. Curr Opin Lipidol，1999，10(3): 245-257.

[2] 中华医学会心血管病学分会，中华心血管病杂志编辑委员会，中国循环杂志编辑委员会. 急性心肌梗死诊断和治疗指南. 中华心血管病杂志，2001，29：710-725.

[3] Gouni-Berthod I ，Giannakdou E ，Faust M ，et al.The peroxisome proliferator- activated receptor +294T/C polymorphism in relation to lipoprotein metabolism in patients with diabetes mellitus type2 and in non-diabetic controls.Atherosclerosis，2005，183(2):336-341.

[4] Skogsberg J ，Kannisto K ，Cassel TN，et al .Evidence that peroxisome proliferator-activated receptor delta influences cholesterol metabolism in men. Arterioscler Thromb Vasc Bio1，2003，23(4):637-643.

[5] Barish GD， Narkae VA ，Evans RM. PPARδ:a dagger in the heart of the metabolic syndrome. J Clin Invest，2006， 116(3):590-597.

[6] Aberle J ， Hopfer I， Beil FU， et al. Association of the T+294C polymorphism in PPAR delta with low HDL cholesterol and coronary heart disease risk in women. Int J Med Sci，2006，3(3):108-111.

[7] Chen S， Tsybouleva N， Ballantyne CM， et al. Effects of PPARalpha， gamma and delta haplotypes on plasma levels of lipids and progression of coronary atherosclerosis and response to statin therapy in the lipoprotein coronary atherosclerosis study. Pharmacogenetics，2004，14 (1) 61-71.

[8] Oliver WR，Shenk JL，Snaith MR，et al.A selective peroxisome proliferator-activated receptor δagonist promotes reverse cholesterol transport. Proc Natl Acad Sci USA，2001，98(9)：5 306-5 311.

[9] Skogsberg J，McMahon AD，Karpe F，et al.Peroxisome proliferator activated receptor delta genotype in relation to cardiovascular risk factors and risk of coronary heart disease in hypercholesterolaemic men. J Internal Med，2003，254：597-604.

[10] Aberle J，Hopfer I，Beil FU，et al.Association of the T+294C polymorphism in PPAR δ with low HDL cholesterol and coronary heart disease risk in women. Int J Med Sci，2006，3(3)：108-111.

[11] Skogsberg J，Kannisto K，Cassel TN，et al.Evidence that peroxisome proliremtor-activated receptor delta influences cholesterol metabolism in men.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2003，23(4)：637-643.

[12] Skogsberg J，McMahon AD，Karpe F，et al.Peroxisome proliferator activated receptor delta genotype in relation to cardiovascular risk factors and risk of coronary heart disease in hypercholesterolaemic men. J Internal Med，2003，254：597-604.

[13] Shin HD，Park BL，Kim LH，et al.Genetic polymorphisms in peroxisome poliferator-activated receptorδassociated with obesity.Diabetes，2004，53(3)：847-851.