流式分选仪FACSAriaⅡ分选GFP阳性乳腺癌MCF-7细胞株的条件优化研究

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)报告基因系统是分子生物学中较常用的技术，通过 GFP的荧光强度间接反映目标基因的表达情况。当转染效率并不很高时，很多科研人员会选择流式分选的方法来筛选GFP阳性的稳转株。在分选GFP 阳性的乳腺癌MCF-7细胞株时，经常会遇到得率低、活性差等问题，本研究以空转GFP载体的MCF-7细胞株为模型，探索最优的机器参数设置。

FACSAria II是实验室中较常见的一种流式分选仪，仪器内置Accudrop系统能准确确定液滴延迟时间，液流监测系统能保证液流断裂位置稳定，常规的分选实验均能达到较高的分选纯度z}。但流式分选得率是较常被忽略的一项指标，高得率能在较短的时间内获得更多的细胞，这对于珍贵的标本或稀有细胞群体的分选尤为重要。流式分选仪喷嘴的大小和分选模式是对分选得率影响较大的两个因素， FACSAria II分选仪常见的有70 , 85和100。三种喷嘴，以及4-way purity, purity和vic;ld三种分选模式、本研究通过改变喷嘴大小和分选模式，寻找最适合IUI C F-7细胞株的分选条件.1.材料与方法

1.1主要试剂和仪器

FACSAria II分选型流式细胞仪、质控微球 Cvtometer Setup and Tracking Beads(货号:642412)、延迟微球Accudrop Beads(货号:345249)均为美国 Becton Dickinson公司产品;Vi-Cell XR细胞活力分析系统(美国Beckman Coupe动;D 1\R p; VI培养液、胎牛血清FBS,PBS粉剂(货号:21600 - 0069)均购自美国 Gibc。公司。

1.2细胞培养

GFP空载体转染MCF-7细胞株由本实验室构建。 C F-7细胞株采用10%胎牛血清DMER}T培养液进行培养，置于37 0C ,5% CO:培养箱内培养，3d 传代一次。

1.3流式细胞仪调试

FACSAria II流式分选仪以D1二为操作软件，革肖液为无菌PBS。每次开机后选择合适的喷嘴(nozzle)和鞘液压力(sort setup )，打开主液流(stream )，相对固定液滴振荡频率(Fred )，调节液滴振动振幅(Amply，使液滴断裂充电位置固定生3。液流稳定后进人 CS&T模块，按照提示操作上样CS&T质控微球，质检通过后表示机器状态稳定选中主液流上的 " sweet spot”键，仪器会自动调节液滴振动振幅使液流断裂位置保持恒定。按照操作说明，配制Accudrop 微球调试机器的液滴延迟时间(drop delay) -3

1.4更换喷嘴和分选模式

喷嘴大小直接影响鞘液压力、流速等参数，每次更换喷嘴按下列操作步骤:断开液流，换上大小合适的喷嘴，选择相应的鞘液压力和机器配置(configu- ration );重新运行CS&T程序(每次更换CS&T微球后选择baseline，其他选择check performance );重新调试延迟时间。本研究FACSAria II流式细胞仪三种喷嘴所用的主要参数如表1所示。更换分选模式只需在分选设置窗口(sort layout)选择模式4一二aj purity ,purity或yield即可。

1.5流式分选

甸次试验准备1 x 10'一2 x 10'个细胞重悬于 1 mL培养液，充分混匀后3个实验组分别取300 p L 细饱悬液，再取50 },L细胞悬液用于绝对浓度计数，剩下细胞用于机器调试。为排除分选速度对细胞得率和纯度的影响，每次分选控制进样速率为4 000 -- 5 00。个细胞/S。不同实验组选择条件后，用多余的细胞调节电压、设置门的位置，分选出实验组所有 GFl'阳性的细胞分选接收管提前放人500 },L培养液作为缓冲液，偏转的液滴直接落到液面上，减少细胞损伤

1.6分选得率、纯度和活性检测

分选后的细胞由于分选条件不同，最终的体积差异也较大。离心后去除部分上清，剩余约1 mL液体混匀细胞，用移液器精确测量最终体积。取 600 mL放人Vi-Cell XR细胞活力分析系统小管内计数，剩余细胞用于流式细胞术检测分选的纯度。 Vi-Cell XR细胞活力分析系统精确获得细胞的绝对浓度和细胞直径，添加锥虫蓝染料计算活细胞的百分比。得率的计算公式:(分选后绝对浓度x分选后体积)/(分选前绝对浓度x分选前体积x GFP阳性细胞占所有细胞百分比)x100%a

1.7统计学方法

采用GraphPad Primes软件进行统计学分析，结果数据以、士、表示，所有试验均进行3次独立操作。

2结果

2. 1不同喷嘴大小对细胞纯度、得率以及活性的影响 在4-way purity分选模式下，85 },i,m喷嘴条件下分选MCF-7细胞株GFP阳性群体的得率为(56. 33 1 2.62)%，高于100林m条件下的(43. 33士0. 47 )%和 70林m条件下的(37. 67士2.05)%。分选前GFP阳性细胞的百分比为66.4%，而三种喷嘴条件下分选后GFP阳性率均达99%以上。70,85和100 },m喷嘴条件下分选后活细胞的百分比分别为(88. 23 1 0. 97%、( 91. 87士1. OS )%和(95. 33士0. 90 ) 070。

2. 2不同分选模式对细胞纯度、得率的影响 选择85um喷嘴分选GFP阳性的MCF-7细胞.

3讨论

自从流式分选仪诞生以来，流式细胞术和流式分选就在基础研究和疾病诊断等领域发挥着重要作用;5]。流式分选能够在较短时间内从大量细胞群体中准确挑选出目标细胞，多参数分析的优点更是其他方法所无法比拟。流式分选绝大部分为电荷式分选，细胞通过检测区域后会被高频率的振荡断裂成均匀的小液滴，包裹有目标细胞的液滴会被充上相应的电荷，带电液滴经过高压偏转板后会发生偏转，落人相应的收集容器中〔5,C>。实际分选试验中，经常会发现分选后得到的细胞数远小于理论值。目标细胞的丢失可能有两方面原因:首先是冲突事件的发生;其次是导致细胞死亡的因素，如鞘液压力太大、偏转细胞落在管壁上、某些细胞的易碎性、不合适的鞘液或培养基、分选时间太长以及高电压的影响等。

流式分选直接分选的是包裹细胞的液滴，理想 J清况下1个或几个液滴中包裹有1个细胞，但是高速分选时，有时会遇到1个液滴中包裹2个或2个以上细胞的情况，称为冲突事件。一般的分选都有两种模式可选，pur沂模式偏重于纯度，有非目标细胞该液滴就不分选;yield模式偏重于得率，只要有目标细胞该液滴就分选〔8，9}。 FACSAria }流式细胞仪有三种模式，4-way purity ,purity和yield模式，4-way purity 对纯度要求最高，yield对得率要求最高，而purity是平衡两者之间的一种模式。本研究结果也证实，得率和纯度是两个矛盾的选项，高得率的yield模式纯度仅为%2%。考虑到分选速度仅为5 000个细胞/s, 如果分选速度加快，细胞间的距离减小，冲突事件的概率增大，分选纯度也会进一步下降。因此，选择 85 um喷嘴分选MC F-7-GFP稳转株，均衡纯度和得率的purity模式最合适。

工程师在设计一机器时就已经注意到喷嘴大小和鞘液压力对细胞存活的影响。流式细胞仪鞘液及细胞流的高速流动都是由压力驱动的，小的喷嘴会引起压力增加，对应的流速及振荡频率也会增加“) 因此，一般来说，大的喷嘴、低速低压有利于细胞的存活，而且大的喷嘴会形成大的液滴，会对细胞起到缓冲作用。但是大喷嘴每秒产生的液滴太少(振荡频率小)，满足不了高速分选的需求，如本研究中 100 um的喷嘴对应20 psi的低压和30 kHz的振荡频率，每秒只能产生30 000个液滴，为保证分选纯度一般最多3个液滴里面有1个细胞，即分选速度上限为 10 000个细胞//s，远低于目前高端分选机器最高 70 000个细胞//s的水平。因此，在很多分选实验中，不影响细胞活性的情况下尽量选择较小喷嘴以提高分选速度。本研究结果表明，选择85 p,m喷嘴时得率最高，而70 um喷嘴对应70 psi的高压，破碎细胞增多导致得率下降;选择100 Nm喷嘴细胞活性高于 85 um喷嘴，但得率低于85 um喷嘴。这看似矛盾的现象可能可以用冲突事件来解释，100 um喷嘴每秒产生的液滴少，目标细胞和非目标细胞位于同一液滴的概率增加，在偏重纯度的4-way purity模式下机器会选择丢弃目标细胞引起得率下降。本研究结果显示，相对于85 um和100u喷嘴，最常用的 70um喷嘴分选17一18 um ( Vi-Cell XR细胞活力分析系统测量的悬浮MCF-7细胞直径大小)的乳腺癌细胞株MCF-7，不论分选得率还是活性均为最低; 100 u喷嘴条件得率低于85 um喷嘴，其活性略优于85 um喷嘴，但100 um喷嘴对应的振荡频率最小，因此分选速度远小于85 um喷嘴。综合纯度、得率、活性和分选时间各要素，FACSAria II流式细胞仪 85 um喷嘴条件分选MCF-7细胞株较合适。

本研究主要探讨了不同喷嘴大小和分选模式对分选结果，特别是分选得率的影响;但分选是个复杂的过程，还有许多影响因素需要进一步探索。首先，本研究是在固定流速下探讨其他变量的变化，5 000 个细胞/s的速度是为了保证每个喷嘴都能达到最高的分选纯度，但是实际研究中，进样速率每秒可能达到上万甚至数万个细胞。流速对分选效率的影响很大，流速太快会引起纯度和得率下降，流速太慢会延长分选时间，实际实验时需要权衡。其次，本研究是以表达GFP的MCF-7细胞株为研究对象，证明直径 17 -18 um的MCF-7细胞株用85 p,m喷嘴较合适，我们分选17 um左右的HepG2-GFP细胞株也得到类似结论。但是对于13 um的白血病细胞株NALM- 6-GFP的分选，我们发现使用70 um喷嘴分选得率最高，因此选择喷嘴时要考虑细胞直径以及细胞易碎性等因素。另外，荧光素或者荧光蛋白的强度以及荧光素的组合也会影响分选的结果。荧光强度高，阴性群体和阳性群体能完全分离开，分选效果好;而分选一些弱阳性的非独立群体，可能会出现纯度低、得率低的问题e7。总之，分选操作人员需要充分了解分选的原理和机器的性能状态，针对不同的分选实验选择最合适的参数，在条件允许的情况下，做好预实验摸索出最科学的方法。

参考文献

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