TGFβ1 mRNA在肺腺癌组织中的表达

作者:朱红,项锋钢作者单位：青岛大学医学院病理学教研室，山东 青岛 266003

   【摘要】  目的 通过检测转化生长因子β1（TGFβ1）在肺腺癌中的表达水平，探讨其与肺腺癌分化程度、TNM分期及预后等的相关性。方法 应用TaqMan探针，GAPDH为内参照，建立实时荧光定量PCR反应体系，对TGFβ1 mRNA在肺腺癌中的表达进行检测。结果 肺腺癌组织中TGFβ1 mRNA表达水平显著高于癌周正常肺组织(t=10.46,P<0.01),TGFβ1的表达与淋巴结转移及TNM分期有关（t=2.94、2.39,P<0.01、0.05），并且随病人术后生存期的延长，TGFβ1表达水平有降低的趋势。结论 TGFβ1 mRNA高表达对肺腺癌的进展及转移起促进作用，可作为判断肺腺癌病人预后的指标。

【关键词】  肺肿瘤 受体 转化生长因子β 聚合酶链反应

    TGFβ1 mRNA EXPRESSION IN LUNG ADENOCARCINOMAZHU HONG, XIANG FENGGANG(Department of Pathology, Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China) ［ABSTRACT］ObjectiveTo study the expression of transforming growth factor β1 (TGFβ1) in lung adenocarcinoma and its correlation with tumor differentiation, TNM staging and prognosis.MethodsUsing TaqMan probe and inner control GAPDH gene, a fluorescent quantitative PCR reaction system was established to detect TGFβ1 mRNA in the cancer tissue.ResultsThe expression of TGFβ1 mRNA was markedly higher in the cancer than in normal tissue (t=10.46,P<0.01) and showed correlation with lymph node metastasis (t=2.94,P<0.01) as well as TNM staging (t=2.39,P<0.05).  The longer survivals had a lower TGFβ1 expression than those with shorter ones.ConclusionThe high expression of TGFβ1 mRNA plays a positive role in tumor  progression and metastasis, which can be served as a prognostic parameter for the disease.

    ［KEY WORDS］lung neoplasms; receptors, transforming growth factor beta; polymerase chain reaction

    转化生长因子β(TGFβ)是一组具有调节细胞生长和分化功能的超家族多肽，其中TGFβ1是人体内的主要存在形式。TGFβ1对肿瘤细胞的生长具有双向调节作用[1]。研究显示，在肿瘤生长早期，TGFβ1通过抑制细胞从G1期进入S期而发挥对肿瘤细胞生长的抑制作用[2]。而在肿瘤的发生进展过程中，机体对TGFβ1反应性降低，并通过对机体免疫系统的抑制、促进肿瘤新生血管的形成而促进肿瘤细胞过度生长[3]。相对于正常肺组织，TGFβ1在肺癌中表达多为增加，但多数的研究都是应用免疫组化或ELISA法对组织或血清中的蛋白水平进行检测。而通过实时荧光定量PCR进行TGFβ1 mRNA水平的研究则罕见文献报道。本研究选用TaqMan探针对TGFβ1在肺腺癌中的表达进行检测，探讨其与肺腺癌临床病理学特点的关系。

    1  材料与方法

    1.1  材料来源

    选用青岛大学医学院附属医院病理科1999～2001年经病理诊断为肺腺癌的手术切除肿瘤组织及癌旁肺组织标本62例，病人术前均未经化学治疗或放射治疗，术后均随访5年以上。其中男27例，女35例；年龄38～73岁，平均54.9岁；淋巴结有转移者20例，淋巴结无转移者42例；TNM分期Ⅰ期41例，Ⅱ期11例，Ⅲ期10例；术后半年内死亡者15例，5年及以上生存者14例。

    1.2  试剂和仪器

    TGFβ1、GAPDH引物及探针购自美国ABI公司的Assayon demand TaqMan Gene Expression Assays。实时荧光定量PCR仪 ABI PRISM 7700 Sequence Detection System 购自美国PE公司。

  1.3  方法

    1.3.1  RNA提取及cDNA合成  从癌组织及癌旁正常肺组织的冷冻组织块中按RNA试剂盒说明书提取并鉴定RNA。取5 μg经DNase Ⅰ处理过的RNA以OligodT为引物进行逆转录。10 μL体系中含有1×逆转录缓冲液，5 mmoL/L 的MgCl2,0.01 moL/L DTT, 40 U RNase抑制剂，50 U SuperScript Ⅱ RT，0.1 mmol OligodT，5 μg RNA。

    逆转录反应条件为：42 ℃ 50 min, 70 ℃ 15 min。将合成的cDNA储存于-20 ℃冰箱中，用于PCR反应。

    1.3.2  实时PCR扩增  25 μL反应体系中有含有25 ng RNA的cDNA模板，1×PCR TaqMan Universal Master Mix和1×TaqMan Gene Expression Assay Mix（均购自美国ABI公司）。 PCR扩增反应条件：50 ℃ 2 min、95 ℃ 2 min，1个循环；95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，40个循环。

    1.3.3  结果分析  cDNA量的标准化是通过看家基因GAPDH做内参照来完成的。每个PCR反应板中均包括来自正常肺组织的cDNA作为校对。定量分析采用相对定量法[4]。

    2  结    果

    2.1  TGFβ1 mRNA表达水平

    肺腺癌TGFβ1 mRNA表达量（3.03±2.30）明显高于其相应的癌旁肺组织（1.12±2.42），两组比较差异有显著性（t=10.46,P<0.01）。

    2.2  TGFβ1表达与肺腺癌组织学分化程度及TNM分期的关系

    TGFβ1表达水平与肺腺癌病人的性别、年龄、组织分化程度及肿瘤大小无关，淋巴结转移阳性组TGFβ1的表达明显高于淋巴结转移阴性组（t=2.94,P<0.01）。随肿瘤TNM分期的增加，TGFβ1表达有增高的趋势，TNM Ⅰ期病例TGFβ1表达水平明显低于TNM>Ⅰ期病例（t=2.39,P<0.05）。见表1。

    2.3  TGFβ1表达与肺腺癌病人预后的关系

    随病人生存期的缩短，TGFβ1表达有增加的趋势，其中半年内死亡组病人的TGFβ1表达最高，其次为生存介于半年至5年组病人，而5年以上生存组病人的TGFβ1表达最低，但是经统计学处理差异无显著性。见表1。

    3  讨    论

    作为具有调节细胞生长和分化功能的超家族多肽的主要成分，TGFβ1在肿瘤的发生发展过程中起着双向调节作用。一般认为，在肿瘤形成早期，TGFβ1具有明显地抑制肿瘤形成的作用，而在肿瘤发生、进展和转移过程中，则起促进作用。TGFβ1对早期肿瘤的抑制主要是通过抑制原癌基因 cmyc 的表达使细胞停滞于G1期，以及增进抑癌基因p53及Rb的活性而发挥作用的[5]。另外，TGF表1  TGFβ1表达与肺腺癌临床病理学特点的关系(±s)临床病理学特征nTGFβ1表达水平t或F值P值性别  男272.86±2.50  女353.16±2.17t=0.514>0.05年龄

    β1可以通过抑制淋巴细胞的活性，协助肿瘤细胞逃避机体的免疫监视；以及通过刺激肿瘤组织内新生血管形成及细胞外基质合成而对肿瘤的生长起促进作用[6]。

    通过对TGFβ1蛋白水平检测的研究发现，其在非小细胞肺癌中的表达多为增加，并且其在组织及血清中的高表达与较差的预后相关[7,8]。本文通过对其mRNA水平的检测表明，TGFβ1在肺腺癌组织中的表达明显高于非肿瘤肺组织，并且随着肿瘤分期的升高其表达也增加。说明随着肿瘤的进展，肿瘤细胞可以大量分泌细胞因子，并获得了由其导致的对生长抑制的耐受。本研究还显示，淋巴结转移阳性组的TGFβ1表达水平高于无转移组，提示TGFβ1参与了肺腺癌的转移过程。证明TGFβ1可通过促使细胞外基质分泌，减少基质降解，引起肿瘤不断植入和生长[8,9]。关于TGFβ1与肺癌预后关系的研究目前仍有争议，但我们的结果符合大多数研究的观点，即TGFβ1的高表达与不良预后相关，但是统计学处理无显著意义，认为与标本量较少有关，如果进一步增加标本量，则能更明确地判断TGFβ1在预后判断上的意义。本文应用实时荧光定量PCR技术对TGFβ1 mRNA水平进行检测，弥补了目前大多数研究只是对其进行免疫组化水平上研究的缺陷。TGFβ1在淋巴结转移及高分期和短生存期病例中的高表达，在一定程度上反映了TGFβ1在肿瘤侵袭转移和逃避机体免疫监视上的能力，说明其可能成为有价值的肺腺癌标志物。实时荧光定量PCR快速、特异，可以满足临床和科研的需要，如果联合观察血清和组织中TGFβ1蛋白的表达变化，可提供更多的资料，临床意义会更大。

 (感谢香港大学医学院病理系Dr. Wong M和Ms Tin V在定量PCR方法和技术上给予的支持！)

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[3]REBECCA L，ELLIOTT ， GERARD C B. Role of transforming growth factor beta in human cancer[J]. J Cli Oncol, 2005,23(9):20782093.

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[7]KONG F, JIRTLE R L, HUANG D H, et al. Plasma transforming growth factorbeta1 level before radiotherapy correlates with long term outcome of patients with lung carcinoma[J]. Cancer, 1999,86:17121719.

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