生脉注射液对心搏骤停复律后患者NFκB表达的影响

作者:邹艳果

作者单位：山东大学第二医院急诊科， 济南 250033         【摘要】  目的 观察生脉注射液对心搏骤停患者复律后外周血中性粒细胞核转录因子kappaB(nuclear factorkappaB,NFκB)的活化程度、肿瘤坏死因子ａ(tumor necrosis factoralpha,TNFa)水平及复苏预后的影响。方法 分别用酶免疫组织化学技术和放射免疫法检测外周血中性粒细胞NFκB的活化程度和血清TNFａ水平，并观察患者生命体征和实验室检查指标的变化。结果 ①实验组生命体征恢复时间、程度均优于对照组(P＜0.05)；②对照组NFκB核移位程度、TNFａ水平高于实验组(P＜0.05)；③生脉注射液呈剂量依赖性地抑制中性粒细胞NFκB的活性、血清TNFａ水平(P＜0.05)；④NFκB活性、TNFａ水平同患者生命体征恢复情况呈负相关，生命体征恢复的越好，NFκB活性及TNFａ水平越低。结论 在心搏骤停复律后联合应用生脉注射液和常规抢救药物，确有维护心脏和循环功能、提高心肺脑复苏预后的良好疗效，其作用机理可能是抑制NFκB信号传导通路及其调控的炎症因子。

【关键词】  生脉注射液 心搏骤停 核转录因子κB 肿瘤坏死因子ａ

    resuscitation of cardiac arrest

    ZOU Yanguo1,　XU Rongting1,　HE Xudong2,　XING Jieling1,　SUI Wenjuan1,　SHAO Hua1,　WANG Xinglei1

    (1. Department of Emergency, Second Hospital of  Shandong University, Jinan 250033, China；

    2. Department of Emergency, Weihai Municipal Hospital, Weihai 264200, Shandong, China)

    Abstract: Objective  To observe the effects of Shengmai Injection on NFκB activation of the neutrophile granulocyte, serum TNFa level and the prognosis of resuscitation on patients who had recovered from cardiac arrest. Methods  The enzyme labeled immunohistochemical method was used to determine the NFκB activation degree. Radioimmunity (RI) was used to determine the blood serum level of TNFa. Changes of vital signs and laboratory examination indexes were also observed. Results  ①The time, degree of vital signs recovery of the test group were superior to those of the control group, and the differences were statistically significant (P＜0.05). ② The degree that NFκB moved into the nucleolus and the TNFa level of the control group were higher than those of the test group, and the differences were statistically significant (P＜0.01). ③Shengmai Injection suppressed the activation of NFκB and the blood serum level of TNFa on dosage (P＜0.01). ④ The NFκB activation degree and the TNFa level were negatively correlated with the recovery of vital signs. The better the vital signs recovered, the lower were the NFKB activation and the TNFa level. Conclusion  Shengmai Injection plus routine therapeutics have obvious therapeutic efficiency in protecting  heart function,  supporting good circulation state, and increasing the success rate of CPR possibly by suppressing the NFκB signaling pathway and reducing  NFκB controled inflammation factors in a dosedependent manner.

    Key words: Shengmai Injection; Sudden cardiac arrest; Nuclear factorkappaB; Tumor necrosis factoralpha

    近年研究表明［1，2］，生脉注射液对于提高心搏骤停复苏成功率和加快复苏后患者生命体征恢复方面具有良好的疗效。然而对其作用的分子生物学机制的基础研究并不多见。我们通过本课题研究证实了生脉注射液加快复苏后生命体征的恢复、提高复苏成功率的机理之一是抑制了NFκB信号通路，现报告如下。

    1  材料与方法

    1.1  材料  研究对象为本院急诊科2004年8月至2006年8月收治的心搏骤停经心肺复苏（CPR）后存活的患者35例，随机分为常规治疗组（阳性对照组）和生脉注射液（四川宜宾制药有限责任公司生产，批号为050205、050514、05120923、05070224）治疗组（实验组）。实验组又根据生脉注射液的治疗剂量分成40?mL组和60?mL组,另设阴性对照组。阴性对照组：即健康体检者，共10例，其中男6例，女4例，平均年龄（29.14±13.12）岁。阳性对照组：即常规治疗组，共18例，其中男11例，女7例，平均年龄（33.14±11.32）岁。实验组: 即生脉注射液治疗组，共17例，其中男11例，女6例，平均年龄（34.51±13.41）岁。其中40?mL组9例，男6例，女3例，平均年龄（44.19±17.45）岁；60?mL组8例，男5例，女3例，平均年龄（45.26±17.13）岁。阳性对照组和实验组患者在年龄、性别、心搏骤停原因、自心搏骤停至开始心肺复苏时间、自主循环恢复 (ROSC)时间等临床资料方面比较，差异无显著性（P＞0.05）。

    1.2  方法

    1.2.1  治疗方法  两组患者均按“2000年国际心肺复苏与心血管急救指南”标准进行积极地CPR，抢救措施和急救药物常规应用。实验组在常规急救的基础上，在心搏恢复后立即开始应用生脉注射液，其中①40?mL组：5%GS 250?mL+生脉注射液40?mL静脉滴注，1次/d，连用7?d；②60?mL组：5%GS 250?mL+生脉注射液60?mL静脉滴注，1次/d,连用7?d。

    1.2.2  免疫酶组织化学法检测NFκB活性  所有患者分别在复律即刻、复律后0.5、1、2、4、8?h抽取外周静脉血，每人每次采血约6?mL。加入肝素抗凝后，置于-4?℃冰箱内保存备用。将抽取的CPR患者的外周血离心、取沉淀再加入红细胞裂解液、离心分离出中性粒细胞。实验组和对照组均给予常规免疫组化染色，阴性对照省去一抗，仅给予PBS液作为对照。采用ABC法染色程序，具体步骤参照试剂盒说明书；每张切片任选取10个无重复视野，显微镜400倍下检测，细胞胞浆中有棕褐色颗粒而细胞核呈白色或弱均匀淡褐色为阴性细胞，如细胞核中出现棕褐色颗粒则为阳性细胞，计数阳性细胞百分率（%），并用图像分析仪半定量分析NFκB的活化程度。其中鼠抗人NFκB单克隆抗体检测试剂盒和免疫组化SP试剂盒均购自北京中山生物技术有限公司，酶作用底物DAB（3，3四盐酸二氨基联苯胺）购于武汉博士德公司，小牛血清购于北京元亨生物制品有限公司。

  1.2.3  TNFａ浓度的测定  采用放射免疫法测定血清TNFａ浓度，具体操作按照试剂盒说明进行（试剂盒购自解放军总医院科技开发中心放免所)。

    1.2.4  临床指标  ①心电/或多参数生理监护；②心率、平均动脉压（mBp）和最大耗氧指数（O2max）；③心肌酶谱、尿肌红蛋白（umHb）、肝/肾功能、血生化、白细胞总数和中性白细胞比值（N%）；④血气分析主要监测pH、PaCO2、PaO2、SaO2以及CO2CP共5项；⑤心脏功能按Killip分级标准进行监护记录，主要观察循环稳定状态下的心功能状况。

    1.3  统计学处理  每个参数均以±s表示。两个样本均数间的比较用t检验；多个样本均数间的两两比较，方差齐时进行方差分析，方差不齐时采用秩和检验。所有数据采用SPSS11. 0统计学软件进行分析处理，以P＜0.05为差异有统计学意义。

    2  结  果

    2.1  各组外周血中性粒细胞NFκB免疫组化染色情况  染色结果显示，与阴性对照组相比，阳性对照组和实验组各治疗剂量组NFκB在复苏后0.5?h核转移明显增加（P均＜0.01），并且逐渐增加，到2?h时达到高峰。与阳性对照组相比，实验组在复苏1?h后NFκB核转移明显降低（P＜0.01）。与40?mL组相比，60?mL组在复苏1?h后NFκB核转移降低明显（P＜0.05）；两组NFκB核转移均在复苏后0.5?h逐渐增加，2?h时达到高峰。见表1，表2。

    2.2  各组TNFａ浓度变化  与阴性对照组相比，阳性对照组与实验组在复律即刻TNFａ浓度即有升高（P＜0.01），并逐渐升高直到观察的时间终点,复苏后2?h开始，阳性对照组升高幅度大于试验组(P＜0.01)；各时间点实验组中40?mL组TNFａ浓度高于60?mL组，但只在复律后4?h和8?h时间点差异有统计学意义（P＜0.01）。

    2.3  各组观察指标达到稳定（平衡）的时间  与阳性对照组相比，实验组在心律/心率、mBp、O2max、心肌酶、血生化、肝肾功、血气分析、WBC与N%恢复方面均优于阳性对照组（P＜0.05）。与40?mL组相比，60?mL组在心律/心率、mBp、O2max、心肌酶、血生化、肝肾功、血气酸碱、WBC与N%恢复方面亦优于40?mL（P＜0.05）。见表5 ，表6。

    3  讨  论

    NFκB是最早在成熟B细胞和浆细胞中发现的能与免疫球蛋白κ轻链内含增强子的特异性序列结合的核蛋白，该特异性序列由10?bp核苷酸组成(5GGGACTTTCC3)，被命名为κB［3］。NFκB广泛存在于真核生物中，是一个由复杂的多肽亚单位组成的蛋白家族。p50/RelA(p50/p65)异源二聚体几乎存在于体内所有细胞，且含量最丰富，通常所指的NFκB即为此类。NFκB作为信号传导途径中的枢纽，已证实与炎症、应激、免疫、肿瘤的发生发展、细胞凋亡的调节以及胚胎发育等重要事件有着密切联系［4］。通常情况下，静息细胞胞浆内的NFκB与其抑制蛋白IκB结合在一起，形成三聚体，此时其处于未活化状态，不具有转录激活功能。当细胞受到外界（TNFα、IL1，细菌脂多糖、氧自由基、紫外线等）刺激时,在蛋白激酶和蛋白磷酸酶的作用下,IκB发生磷酸化并从NFκB二聚体上解离, NFκB得以激活。

    心搏骤停复律后，全身缺血的组织细胞恢复血流获得再灌注，引起缺血-再灌注损伤（ischemia reperfusion injury，IRI）［5］。氧自由基大量生成、释放及细胞内钙超载，导致血管内皮细胞肿胀，毛细血管进一步狭窄或闭塞，刚刚获得血液再灌注的组织细胞转而形成了少灌注或无灌注状态，使组织损伤较缺血时进一步加重，器官功能进一步恶化；氧自由基还能裂解及激活补体，激活吞噬细胞，使炎性介质大量释放，形成全身性炎症反应综合征(system inflammatory reaction syndrome,SIRS)，进而可导致复苏后多器官功能障碍综合症（postresuscitation multiple organ dysfunction syndrome，PRMODS）发生［6］，这也正是心搏骤停复律后患者死亡率仍高的原因。而氧自由基、炎性介质（TNFα、IL1β等）正是NFκB的重要的激活因子，在它们的作用下，胞浆内同NFκB/Rel蛋白二聚体相结合的抑制蛋白IκB发生磷酸化、泛素化而降解。NFκB/Rel蛋白二聚体游离出来，迅速进入细胞核，同相关下游因子（如IL1、2、6，TNFα，ET1等）的顺式作用元件相结合，启动相关因子的转录［78］。NFκB作为一种重要的炎症转录因子，调控着许多炎症基因的表达。可见心搏骤停复律后NFκB信号转导通路是缺血再灌注损伤中重要的分子机制，若能减少NFκB的过度活化，可防止SIRS、MODS的发生，提高复苏成功率。

    生脉注射液由人参、麦冬、五味子等中药组成，其功效为益气、生津、固脱，对于各种原因所致的气阴亏虚有良好疗效，具有抗休克、抗心律失常、强心、调节免疫和抗炎等药理作用。孙中吉等［9］证实生脉注射液具有广泛的免疫药理活性，有调节机体免疫功能的作用，它可能是通过抑制巨噬细胞释放TNFa、N0等炎症介质而达到减轻机体组织损伤的作用，使机体自身清除各种病理性物质。我们前期的临床试验已证实生脉注射液有提高复苏成功率、加快复苏后患者生命体征恢复的功效。本研究结果证实，生脉注射液治疗组生命体征、实验室指标的恢复确实优于对照组（P＜0.05），其NFκB结合活性、TNFａ水平明显降低，并且大剂量生脉注射液组低于小剂量组（P＜0.05）。因而推测生脉注射液可能是通过其抗氧化、清除自由基等作用抑制了NFκB的激活通路,进而减少了炎性介质的大量产生而发挥作用的。

【参考文献】  ［1］ 许荣廷，宋慧玲，何旭东，等.中西药联用提高心肺脑复苏成功率的临床研究［J］. 山东大学学报（医学版），2005，43(9):791794.

［2］ 刘业清.参附生脉注射液对心肺脑复苏成功率的影响［J］.辽宁中医杂志，2005，32(5):445446.

［3］ Sen R, Baltimore D. Multiple nuclear factors interact with the immunoglobulin enhancer sequences［J］. Cell， 1986, 46(5):705716.

［4］ Baeuerle P A, Henkel T. Function and activation of NFkappa B in the immune system［J］. Ann Rev Immunol, 1994, 12:141179.

［5］ 金惠铭主编.细胞分子病理生理学［M］.郑州:郑州大学出版社，2002.

［6］ Geppert A, Zorn G, Karth G D, et al. Soluble selectins and the systemic inflammatory response syndrome after successful cardiopulmonary resuscitation［J］． Crit Care Med， 2000， 28(7)：23602365．

［7］ McMurray H F, Parrott D P, Bowyer D E. A standardised method of culturing aortic explants, suitable for the study of factors affecting the phenotypic modulation, migration and proliferation of aortic smooth muscle cells［J］. Atherosclerosis, 1991, 86(23):227237.

［8］ Lawrence R, Chang L J, Siebenlist U, et al. Vascular smooth muscle cells express a constitutive NFkappa Blike activity［J］. Bio Chem, 1994, 269(46):2891328918.

［9］ 孙中吉，卢青．生脉注射液对非高血压性急性缺血性脑卒中血管紧张素和心钠素的影响［J］．中国中西医结合急救杂志，2001，8(6)：373375．