人巨细胞病毒感染致血管内皮细胞损伤机制的研究

作者:王凤

作者单位：实验畸形学教育部重点实验室山东大学医学院微生物学教研室， 济南 250012         【摘要】  目的 观察人巨细胞病毒（HCMV）感染对人血管内皮细胞氧化应激的影响及对血管细胞粘附分子1（VCAM1）和糖基化终产物受体（RAGE）时序性表达的影响，研究HCMV感染致动脉粥样硬化（AS）的作用机制。方法 用HCMV感染血管内皮细胞，用激光共聚焦显微镜检测细胞内活性氧（ROS）的改变；采用RTPCR方法检测不同感染时段细胞VCAM1及RAGEmRNA的表达。结果 HCMV感染血管内皮细胞后，HCMV组荧光强度显著高于对照组（P＜0.01）。感染0?h时，VCAM1mRNA有基础水平的表达，4?h开始升高，8?h时达高峰，12?h开始回落，24?h回落更明显，与0?h比较，均有统计学意义（P＜0.01），48?h接近0?h表达水平（P＞0.05）。感染0?h时，RAGEmRNA有基础水平的表达，4?h开始升高，8?h时表达水平明显升高，随感染时间延长，表达量逐渐增高，感染24?h时达高峰，48?h开始回落，仍维持在较高的水平，各时段与0?h比较，均有统计学意义(P＜0.01)。结论 HCMV感染血管内皮细胞后能够增强氧化应激，促进VCAM1及RAGE的mRNA表达，并且呈时间依赖性。HCMV有可能通过增强氧化应激、上调VCAM1及RAGE的表达介导血管内皮细胞的炎症反应，促进动脉粥样硬化的发生、发展。

   【关键词】  巨细胞病毒 脐静脉 活性氧 血管细胞粘附分子1 糖基化终产物 受体

    WANG Feng, WU  Jianmin,  ZHOU Yabin, LI Shuying, CHENG Yizhe, QI Mei,

    TANG Wei, WANG Hong， LIU Juan,  YU Han

    （Key Laboratory of Experimental Teratology， Ministry of   Education, China; Department of Microbiology,

    School of Medicine, Shandong University, Jinan 250012,  China）

    Abstract: Objective  To explore the mechanisms of cytomegalovirus infection by investigating the changes of reactive oxygen species (ROS) and sequential changes of the vascular cell adhesion molecule1 (VCAM1) and the receptors for advanced glycation  end products (RAGE) in vascular endothelial cells with human cytomegalovirus(HCMV) infection. Methods  Vascular endothelial cells were cultured and then infected by HCMV, then changes of reactive oxygen species were identified by confocal microscopy. Expressions of VCAM1 and RAGE mRNA were determined by reverse transcriptase polymerase chain reaction. Results  Fluorescence intensity was determined at a low level in the control group and was significantly increased in the HCMV group (P＜0.01). VCAM1 mRNA was expressed at a low level at 0 hour, began to increase at 4 hours after HCMV infection and reached a peak at 8 hours. After 12 hours, it began to decrease and significantly decreased at 24 hours, but it was higher than that at 0 hour (P＜0.01). At 48 hours, the VCAM1 mRNA level was close to that at 0 hour (P＞0.05). RAGE mRNA was expressed at a low level in the control group, began to increase 4 hours after HCMV infection, increased to a significant level at 12 hours, and reached a  peak at 24 hours. It significantly decreased  but remained at a relatively high level at 48 hours (P＜0.01). Conclusions  HCMV infection can enhance the oxidative stress and the expressions of VCAM1 and RAGE mRNA in vascular endothelial cells and it may induce an inflammatory reaction by enhancing the oxidative stress and upregulating the VCAM1 and RAGE expressions in endothelial cells, which further facilitates the occurrence and development of atherosclerosis.

    Key words:  Cytomegalovirus; Umbilical veins; Reactive oxygen species; Vascular cell adhesion molecule1; Advanced glycation end products; Receptor    慢性炎症反应以及与此相伴而生的免疫应答现己被普遍认为是动脉粥样硬化发生中的重要因素，人巨细胞病毒(HCMV)被认为是动脉粥样硬化发生的感染因素［1］，但其作用机制尚不清楚。本实验观察了HCMV感染对血管内皮细胞氧化应激的影响及对血管细胞粘附分子1(VCAM1)及糖基化终产物受体(RAGE)表达的影响，进一步探讨HCMV感染致动脉粥样硬化的作用机制。

    1  材料与方法

    1.1  标本来源  HCMV Twone病毒株由湖北师范大学陈则教授馈赠，按常规方法传代、滴定。本实验所用的血管内皮细胞是人脐静脉内皮细胞株ECV304，由本实验室保存，按照常规方法复苏、传代。将生长良好的细胞接种于24孔板，一般传代第2?d细胞长满后用于实验。

    1.2  细胞内活性氧的检测  按100TCID50/0.1?mL浓度接种HCMV Twone病毒株于24孔板中生长良好的ECV304单层细胞，37?℃吸附1?h后，弃病毒液，用含2%血清的培养基培养ECV304细胞0.5?h，弃培养液，用PBS洗3次，按照试剂盒(购自美国Sigma公司)说明，用无血清培养，按1∶1?000液稀释DCFHDA，按照细胞培养液量的一半加入上述处理好的细胞，37?℃细胞培养箱内孵育30?min。用无血清培养液洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DCFHDA。处理后，用激光共聚焦显微镜直接观察并拍照，分析。以未感染病毒的正常细胞为对照。

    1.3  RTPCR方法检测VCAM1及RAGE的表达  VCAM1和RAGE引物序列参照文献［2,3］，采用βactin为内对照，由上海生物工程技术服务有限公司合成，扩增片段长分别为241?bp、480?bp和375?bp，引物序列分别为：VCAM1：正义5′CCCTTGACCGGCTGGAGATT3′，反义5′CTGGGGGCAACATTGACATAA

  AGTG3′；RAGE：正义 5′CACCTTCTCCTGTAGCTTCA3′，反义 5′TGCCACAAGATGACCCCAA3′；βactin：正义5′ACACTGTGCCCATCTACGAGGGG3′，反义 5′A

    TGATGGAGTTGAAGGTAGT TTCGTGGAT3′。

    1.4  VCAM1和RAGEmRNA表达的检测  采用UNIQ10柱氏Trizol总RNA抽提试剂盒（购自上海生物工程技术服务有限公司）抽提总RNA.，于紫外分光光度计下测定A260/A280，稳定于1.8 2.0为可行，-80?℃保存备用。逆转录反应按照试剂盒（购自MBI公司）说明进行，取总RNA2?μg，0.2?μg/μL随机引物1?μL，DEPC水补至12?μL，70?℃水浴5?min，冰浴30?s。加入20?U/μL RNA酶抑制剂1?μL，10?mmol/LdNTP 2?μL，5×反应缓冲液4?μL，25?℃水浴5?min，加人200?U/μL MMμLV逆转录酶1?μL，使反应总体系为20?μL。反应混合物25?℃水浴10?min，42?℃水浴60?min，70?℃ 10?min，置冰上，结束反应。PCR反应试剂盒购自大连宝生物公司，反应体系包括cDNA 5?μL，Premix Taq 25?μL，10?μmol/mL上、下游引物各2?μL，加灭菌蒸馏水至终体积为50?μL。按以下条件进行循环：首轮变性94?℃ 4?min，后续变性94?℃ 50?s，退火50?s，VCAM1和RAGE退火温度分别为52?℃和55?℃，延伸72?℃ 60?s，共35个循环，终末循环延伸72?℃ 5?min。同时对内对照βactin进行扩增。

    1.5  PCR产物的半定量  PCR产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳，溴化乙锭染色，ChemilmagerTM440型光密度扫描分析系统(AlPhalnnotech公司)作定量分析。结果以扩增目的条带与βactin扩增条带的扫描峰面积比表示所扩增目的基因的相对含量。

    1.6  统计学处理  实验均重复3次以上，所有数据均以±s表示，用SPSS统计软件进行方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

    2  结  果

    2.1  HCMV感染对血管内皮细胞氧化应激的影响  见图1。在激光共聚焦显微镜下观察可见，对照组荧光强度（0.95±0.07）较弱， HCMV组荧光强度（1.28±0.06）明显增强，表现为发光细胞数目较多，胞浆内荧光较强，与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。

    2.2  HCMV感染对血管内皮细胞VCAM1表达的影响  HCMV感染血管内皮细胞后，0?h时VCAM1mRNA有基础水平的表达，4?h开始升高，8?h时达高峰，12?h开始回落，24?h回落更明显，与0?h比较，均有统计学意义（P＜0.01），48?h接近0?h表达水平（P＞0.05）。提示，HCMV感染能够促进人脐静脉内皮细胞VCAM1mRNA的表达，并且呈时间依赖性，见图2和图3。

    2.3  HCMV感染对血管内皮细胞RAGE表达的影响  由图2图3可见，0?h时RAGEmRNA有基础性表达（0.38±0.02）；在HCMV感染4?h时RAGEmRNA表达量开始升高（0.60±0.02），随感染时间延长，8?h表达量逐渐增高（1.10±0.07），12?h明显升高（1.27±0.05），24?h时表达量达高峰（1.42±0.03），48?h表达量下降（0.84±0.05）,但仍维持在较高的水平，各时段RAGEmRNA的表达与0?h比较，均明显升高(P＜0.01)。提示，HCMV感染能够促进人脐静脉内皮细胞RAGEmRNA的表达，并且呈时间依赖性。

    3  讨  论

    3.1  HCMV感染对血管内皮细胞氧化应激的影响  氧化应激是指由于活性氧（reactive oxygen species，ROS）过度产生与抗氧化防御机制减弱，两者平衡失调造成的组织损伤。ROS包括过氧化氢和氢氧化物自由基等，是在氧代谢过程中产生的正常中间代谢产物，生理情况下，自由基能被机体内的抗氧化机制消除，氧化应激时，ROS的生成和清除失衡，体内ROS增多，则会引起细胞和组织的损伤。本研究结果显示，HCMV感染血管内皮细胞时，能够增强氧化应激，促进细胞内ROS生成。ROS生成增加，在动脉粥样硬化的病理过程中起着非常重要的作用，它能够增加血管内皮细胞通透性、白细胞浸润、影响细胞的增殖活性、引起细胞的死亡和凋亡、干扰细胞内信号传导，介导体内单核细胞的迁移、分化及巨噬细胞分泌细胞因子等［2］。血管壁内过多生成的ROS能使内皮下间隙的LDL氧化修饰生成OXLDL，这是动脉粥样硬化病理过程中最重要的早期事件之一，所以，HCMV作用内皮细胞时，可通过增强氧化应激，参与血管内皮的损伤，促进动脉粥样硬化的发生与发展。

    3.2  HCMV感染对血管内皮细胞VCAM1表达的影响  粘附是动脉粥样硬化的早期事件和始动环节，细胞粘附分子介导了这一过程，而粘附分子的表达就是其首要步骤。正常情况下，细胞粘附分子的表达受到严格的调控，在静息状态下，血管内皮细胞仅表达少量的VCAM1，以维持多细胞生物体正常的形态、结构和功能。在某些刺激因素作用下，可致内皮细胞活化，VCAM1表达增加。本实验结果显示，HCMV感染能够上调血管内皮细胞VCAM1的mRNA表达，并且呈时间依赖性。VCAM1属于免疫球蛋白超家族中的成员，是影响单核细胞与血管内皮细胞粘附功能的最重要的粘附分子。VCAM1的表达，介导单核细胞与血管内皮细胞牢固粘附并促使单核细胞向内皮细胞下迁移，摄取脂质转化为泡沫细胞，加速动脉粥样硬化早期斑块的形成；同时粘附分子的表达上调，能够促进带有潜伏HCMV的细胞与内皮细胞间的接触和粘附，细胞与细胞的接触，使病毒激活，复制产生具有感染性的病毒颗粒，从而有利于病毒感染在细胞间传播和扩散，加速疾病的进程。

    3.3  HCMV感染对血管内皮细胞RAGE表达的影响  RAGE是一种多配体受体，能够介导细胞功能紊乱，在许多炎症过程中具有重要的作用［3］。多种细胞上有RAGE的表达，正常血管内皮仅有少量表达，当细胞处于激活或应激状态如糖尿病、炎症、神经系统疾病及心血管疾患时，RAGE表达急剧增加［4］，进而加重了疾病病变。应用基因敲除术抑制RAGE基因的表达或阻断RAGE的受体后，能有效控制疾病的进展［56］。本研究首次检测了HCMV对ECV304细胞糖基化终产物受体时序性表达的影响，结果显示，HCMV感染能够促进RAGE受体的表达，并且呈时间依赖性。RAGE与动脉粥样硬化关系密切，阻断动脉粥样硬化斑块中的RAGE受体能够抑制动脉粥样硬化病变的发展［7］。研究资料［8］显示，白细胞、血管内皮细胞上的RAGE受体通过与其配体相互作用，能够使细胞内产生氧化应激、ROS产生增加，细胞内产生的氧自由基可直接激活或损害细胞内的一些蛋白质、DNA、脂质等，也可诱发膜的超氧化，使维持离子稳态的膜蛋白功能受损，从而引起钙离子内流，胞内钙离子浓度增高，最终导致细胞的结构、功能、代谢异常，甚至细胞死亡；ROS产生增加，进一步触发细胞内的信号级联反应，使丝裂原活化蛋白激酶（Mitogenactivated protein kinase，MAPK）等活化，最终导致核转录因子NFκB等的活化，激活的核转录因子NFκB（nuclear factorkappa B，NFκB）导致多种基因的转录激活，这些基因大多与免疫、炎症及动脉粥样硬化高度相关，如细胞因子、粘附分子等表达增加，导致血管渗透性增加、单核细胞对内皮细胞的粘附性增强，从而启动并促进动脉粥样硬化的发生、发展，同时，核转录因子NFкB的活化还可反馈上调RAGE的表达，呈现一恶性循环，导致疾病的发展。RAGE与配体作用后引起的氧化应激还能够激活细胞内其它重要的信号转导通路，包括cdc42/rac，p21ras，MAPK等，MAPK的激活可促进细胞的增殖、浸润和基质金属蛋白酶的活化。另一方面，内皮细胞上的RAGE还可作为粘附受体直接与白细胞整合素β2相互作用参与炎症细胞的聚集［9］，因此，HCMV感染能够通过上调RAGE的表达介导动脉粥样硬化的炎症反应。

 综上所述，HCMV感染有可能通过促进ROS产生，激活NFκB途径,并进一步促进了VCAM1及RAGE受体的表达，从而启动并加速动脉粥样硬化的发生、发展。本课题为阐明HCMV感染致动脉粥样硬化的炎症反应提供了新的理论依据。

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